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发布时间：2025/3/28 11:48:56 阅读次数：29
过氧化物酶(POD)试剂盒说明书
产品内容：
提取液：20mmol/LKH2PO4 100mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0) 20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：愈创木酚 0.2mL×1 瓶，4℃保存；用时加入 3mL 试剂一，现配现用，可 4℃保存 一周；
试剂三：30%过氧化氢 3 mL×1 瓶，4℃保存。 产品说明：
POD（EC 1.11.1.7）广泛存在于动物、植物、微生物中，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合 物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。POD 在有过氧化氢存在的情况下，能使愈创 木酚发生氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470nm 有最大光吸收。
需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰和
蒸馏水
操作步骤：
一、粗酶液提取：
1 、细菌、细胞或组织样品的制备
收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液，超声 波破碎细菌或细胞（功率 20％，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min ，取上清， 置冰上待测。
称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待 测。
2 、血清（浆）样品：直接检测。
二、测定步骤：
1 、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 470nm ，蒸馏水调零。
2 、 测定前将试剂一、二和三在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）放置 10min 以上。
3 、 样本测定表
| 试剂名称 (µL） | 测定管 |
| 试剂一 | 120 |
| 试剂二 | 30 |
| 试剂三 | 30 |
| 蒸馏水 | 60 |
| 样本 | 5 |
在 EP 管中按顺序加入上述试剂，立即混匀并计时，立即取 200µL 转移至微量玻璃比色皿或 96
孔板中，记录 470nm 下 30s 时的吸光值 A1 和 1min30s 后的吸光值 A2 。计算∆A ＝A2-A1。 POD 活性计算：
用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
1 、按血清（浆）体积计算
单位定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 POD（U/mL）= ∆A÷0.01×V 反总÷V 样÷T =4900×∆A
2 、按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 POD（U/mg prot）= ∆A÷0.01×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T =4900×∆A÷Cpr
3 、按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 POD（U/g 鲜重）= ∆A÷0.01×V 反总÷（W÷V 样总×V 样）÷T =4900×∆A÷W
4 、按细菌或细胞数量计算
单位定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。 POD（U/104 cell）= ∆A÷0.01×V 反总÷（500÷V 样总×V 样）÷T =9.8×∆A
用 96 孔板测定的计算公式如下
1 、按血清（浆）体积计算
单位定义：每 mL 血清（浆）在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 POD（U/mL）= ∆A÷0.005×V 反总÷V 样÷T =9800×∆A
2 、按样本蛋白浓度计算
单位定义：每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 POD（U/mg prot）= ∆A÷0.005×V 反总÷（Cpr×V 样）÷T =9800×∆A÷Cpr
3 、按样本鲜重计算
单位定义：每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 POD（U/g 鲜重）= ∆A÷0.005×V 反总÷（W÷V 样总×V 样）÷T =9800×∆A÷W
4 、按细菌或细胞数量计算
单位定义：每 1 万个细菌或细胞在每mL 反应体系中每分钟A470 变化 0.005 定义为一个酶活力单位。 POD（U/104 cell）= ∆A÷0.005×V 反总÷（500÷V 样总×V 样）÷T = 19.6×∆A
V 反总：反应体系总体积，0.245mL；V 样：加入样本体积，0.005mL；V 样总：加入提取液体 积，1 mL；T ：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或 细胞总数，500 万。
注意事项：
1 、 如一次测定的样本数量较多，可将试剂一、二、三和蒸馏水按照比例混合，在 37℃（哺乳动物） 或 25℃（其它物种）放置 10min ，测定时加入 240µL 即可。
2 、 样本测定值如果小于 0.005 ，可将反应时间延长到 3-5 分钟，计算时除以反应时间即可；如果高 于 0.5 ，可将样本用提取液进行稀释。计算时乘以相应的稀释倍数即可。
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