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可溶性淀粉合成酶（Soluble starch synthase，SSS）试剂盒说明书

发布时间：2025/3/28 11:50:18 阅读次数：37

货号：GV-W-C404 规格：100 管/96 样

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

SSS（EC 2.4.1.21）通常以游离态存在于质体基质中，催化淀粉链延长，主要负责支链淀粉的合成。

测定原理

SSS催化ADPG与淀粉引物(葡聚糖)反应，将葡萄糖分子转移到淀粉引物上，同时生成ADP，在反应体系中添加的丙酮酸激酶、己糖激酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化NADP+ 还原为NADPH，NADPH生成量与前一步反应中ADP生成量呈正比，340nm下测定NADPH增加量即可计算SSS 活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存；试剂一：40mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 14mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂 4℃ 保存一周；

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 8mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂 4 保存一周；

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 10mL 试剂一充分混匀备用；用不完的试剂 4℃ 保存一周；

试剂五：液体×1 支，-20℃保存；临用前加入 500μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存一周；

试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 500μL 蒸馏水，充分溶解备用；用不完的试剂 4℃保存一周；

粗酶液制备

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、在EP管中按顺序加入下列试剂

试剂名称（μL）	测定管
样本	75
试剂二	135

混匀，30℃保温20min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却
试剂三	75
混匀，30℃保温30 min，置沸水浴中1 min（盖紧，防止水分散失），冰浴冷却，10000g 25℃ 离心10min，取上清液（如果一次性测定样本较多，可以将试剂四、五和六按比例配成混合液）
上清液	150
试剂四	100
试剂五	5
试剂六	5

混匀后立即340nm波长下记录初始吸光度A1和2min后的吸光度A2，计算ΔA=A2-A1。注意：试剂二如有沉淀，加入之前要使之充分溶解混匀。

SSS 活性计算

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： 1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T×稀释倍数

=528×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

SSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T×稀释倍

数=528×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.85×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.73；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

b. 使用96孔板测定的计算公式如下： 1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。SSS（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V样) ÷T×稀释倍数

=1056×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

SSS 活性（nmol/min /g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷（V 样÷V 样总×W）÷T×稀释倍

数=1056×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.85×10 -4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L/mol/cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.075 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；稀释倍数：1.73；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。