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腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒说明书

发布时间：2025/3/28 14:32:31 阅读次数：27

货号：GV-W-C403 规格：100管/96样

腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGP）活性测定试剂盒说明书

微量法

正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸与ATP反应生成淀粉合成的直接前体ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步骤。

测定原理

AGP催化的逆向反应生成G1P，在反应体系中添加的磷酸己糖变位酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶依次催化生成6-磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下测定NADPH增加速率，即可计算AGP活性。

需自备的的仪器和用品

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存;

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入6.4mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂仍 4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入4.8mL蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂仍-20℃保存；

粗酶液制备

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、试剂一置30℃保温10min以上。

3、在EP管中按顺序加入下列试剂（如果一次性测定样本较多，可以将试剂一和试剂二按比例配成混合液 1）

试剂名称（μL）	测定管
试剂一	40
试剂二	64
样本	8
混匀，30℃保温15min，置沸水浴中1min（盖紧，防止水分散失），冰浴迅速冷却后加入下列试剂（如果一次性测定样本较多，可以将试剂一和试剂三按比例配成混合液 2）
试剂一	120
试剂三	48

混匀后立即转移 200μL至微量石英比色皿或 96 孔板中， 340nm波长下记录初始吸光度A1和 2min后的吸光度A2，计算 ΔA=A2-A1。

AGP 活性计算

a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGP（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=2813×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 样÷V 样总）÷T

=2813×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.8×10 ^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.008 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。

b.使用96孔板测定的计算公式如下：

1、按样本蛋白蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活性单位。

AGP（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=5626×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按照样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟催化产生1nmol NADPH定义为一个酶活力单位。

AGP（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T

=5626×ΔA÷W

V 反总：反应体系总体积，2.8×10 ^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.008 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量。