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硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒说明书

发布时间：2025/3/28 14:32:59 阅读次数：27

硝酸还原酶（NR）活性检测试剂盒说明书微量法

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

货号：GV-W-A800

规格：100T/96S 产品内容：

诱导剂储备液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

提取液：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 15mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加入 2mL 提取液溶解，可分装后-20℃保存，避免反复冻

融。-20℃保存 2 周。

产品说明：

NR（ EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3¯ +NADH+H＋→ NO2¯ +NAD＋ +H2O，NADH 在 340nm 下有特征吸收峰，340nm 下吸光值的变化即可表示酶活。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品测定的前处理

1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可）避光，浸泡 2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻 30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理）

2、称取约 0.1g 样本，加入 1mL 提取液，冰浴研磨，4000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。二、测定步骤

1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在 EP 管中加入下列试剂）

试剂名称（µL）	测定管	空白管
样本	12	-
提取液	68	80
试剂一	108	108
试剂二	12	12

充分混匀后测定 340nm 下的初始值 A1，37℃反应 30min 后再次测定吸光值A2，计算△A 测定管=A1 测定管-A2 测定管，△A 空白管= A1 空白管-A2 空白管，△A=△A 测定管-△A 空白管。

注意：空白管只需测 1-2 次。

三、NR 活性计算：

1、按微量石英比色皿计算：

（1）按样本鲜重计算：

酶活单位定义：每小时每 g 鲜重样品中消耗 1µmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。

NR（U/g 鲜重）=[∆A×V 反总÷（ε×d）×106]÷(W÷V 提取×V 样) ÷T=5.359×∆A÷W。

（2）按样本蛋白浓度计算：

酶活单位定义：每小时每 mg 组织蛋白消耗 1µmol NADH 的量为一个 NR 活力单位。

NR（U/mg prot）=[∆A×V 反总÷（ε×d）×106]÷(V 样×Cpr) ÷T=5.359×∆A÷Cpr。

V 反总：反应体系体积，2×10-4L；V 样：吸取样本体积，0.012mL；V 提取：加入提取液体积， 1mL；T：反应时间，0.5h；ε：NADH 的摩尔消光系数：6220 L/mol/cm；d：比色皿光径：1cm；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；106：单位换算系数，1mol=106nmol。

2、按 96 孔 UV 板计算：

将上述公式中的 d-1cm 换为 d-0.6cm（比色皿光径）进行计算即可

注意事项：

1、当测定的吸光值大于 1.5 或者∆A 大于 0.5 时，建议将上清液稀释后测定。

2、 ∆A 测定过小（小于 0.01），可延长酶促反应时间。

3、建议一次测定不要测定过多样品以免耽误过多的酶促反应时间。

4、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.05。