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一管式双链 cDNA 合成试剂盒说明书

发布时间：2025/4/11 18:34:29 阅读次数：9

CAT#:GV-220627-10
低温运输，-20℃保存

一管式双链 cDNA 合成试剂盒

产品及特点
本产品是用于一管式双链 cDNA 合成的试剂盒。cDNA 第一链合成的原理是以 Oligo dT 为通用引物的、MMLV 催化的逆转录反应。其原理如下：cDNA 第二链合成的原理是用 RNase H 使 RNA-DNA 杂合链中的 RNA 产生切口，再用 E.coli DNA Polymerase I 的切口平移(nick translation)活性进行 RNA 链取代合成 cDNA 第二链，其原理图咨询客服。

本产品具有下列特点：
1. 即开即用，含有合成两条 cDNA 链的所有试剂，用户只需要提供mRNA。
2. 一管式进行，第一链 cDNA 合成后直接进入第二链的合成。
3. 所得双链 cDNA 可以直接用于后续的常规 PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等。
4. 本试剂盒足够 10 次 80 uL 体系的双链 cDNA 合成反应。
5. 本产品只能用于科研。

规格及成分    本产品使用五孔盒包装
成份                                                                             编号                规格      包装材料
cDNA 第一链合成反应液（含 Oligo-dT 和 dNTP）    220627a          50 uL    0.5 mL 绿盖管
MMLV 逆转录酶                                                          11-220628        10 uL    0.5 mL 红盖管
5×cDNA 第二链合成反应液                             220627b          160 uL    0.5 mL 白盖管
20×cDNA 第二链合成酶混合液                                   220627c          40 uL      0.5 mL 黄盖管
超纯水                                                                           210806           1 mL      1.5 mL 蓝盖管
使用手册                                                                        220627sc        1份   无

运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备物品：mRNA 提取试剂盒
使用方法
一：mRNA 的制备
本试剂盒不提供 mRNA 提取试剂，用户需自备相关试剂。
二：双链 cDNA 的合成
1. 在一个干净的塑料离心管中，按下表设置 cDNA 合成反应：
成分                                                                                                  用量
自备样品 mRNA                                                                             4 uL（0.5-2ug）
cDNA 第一链合成缓冲液    （含 Oligo dT 引物和 dNTP）                    5 uL
                              70℃ 2 分钟后室温放置 2 分钟，短暂离心
加入 MMLV 逆转录酶                                                                           1 uL
                              轻柔吹打混匀后 42℃保温 90 分钟合成第一链 cDNA
超纯水                                                                                                    48 uL
5×cDNA 第二链合成缓冲液                                                                     16 uL
20×cDNA 第二链合成酶混合液                                                                 4 uL
                               共 80uL。吹打混匀后，短暂离心， 16℃保温 2 小时
2. 如果需要将双链 cDNA 平末端化，则需加自备 T4 DNA 聚合酶 2 uL ，轻柔吹打混匀后，16℃继续保温 30 分钟。然后进入下一步。如果不需要将 cDNA 平末端化，则直接进入下一步。
3. 终止反应：如果后续实验(如电泳)不担心 EDTA 的影响，可以直接加入 4 uL 0.2M EDTA 溶液终止反应，然后将样品放-20℃长期保存。如果后续实验（如 PCR 扩增）不担心 cDNA 的单双链状态，可以 95℃保温 10 分钟终止反应。如果后续实验既受 EDTA 影响，又不能是单链 DNA，则可以用 PCR 过柱纯化法纯化。
4. 电泳 5uL 检测 cDNA 质量。如果 cDNA 在 0.5-10Kb 的范围内呈模糊一片，则 cDNA 合格。如果没看见 cDNA 或有其他异常，需查找原因后再继续。
5. 所得 cDNA 可以直接用于后续的常规 PCR、real-time PCR、cDNA 文库构建、抑制性差减杂交等实验。
关联产品    第一链 cDNA 合成试剂盒
20230902dx