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无缝克隆试剂盒说明书

发布时间：2025/4/17 15:21:15 阅读次数：10

CAT#:JW-221024-20
低温运输，-20℃保存

无缝克隆试剂盒Seamless Cloning and Assembly Kit

产品及特点
无缝克隆是一种简单、快速、高效的 DNA 定向克隆技术，该技术突破传统，不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制，利用同源重组的原   理，可将任何 DNA 片段克隆至任何载体的任何位点。反应及转化时间短，阳性率达 95%以上。此反应的示意图如下：
本产品特点总结如下：
1.   简单、高效地定向克隆 DNA 片段。
2.   可同时定向克隆两个或多个 DNA 片段。
3.   不依赖内切酶和连接酶，不受限制性内切酶酶切位点的限制。
4.   省时，反应时间加转化时间短至 20 分钟。
5.   PCR 产物（仅有目的条带、无非特异条带和引物二聚体）可直接进行重组反应，无需纯化。
6.   本产品足够 20 次 20μL 体系的无缝克隆。
7.   本产品只能用于科研。
规格及成分    本产品使用塑料袋包装
成份                        编号            规格             包装
2×无缝克隆 Mix    221024a      200 μL    1.5 mL 本色管
超纯水               210806        1 mL      1.5mL 黄盖管
使用手册                221024sc    1 份            无

运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。
自备试剂：线性化载体、DNA 片段、感受态细胞、SOC 或 LB 培养基和培养皿（含抗菌素和不含的）

使用方法    一、线性化载体的制备：
可通过单酶切、双酶切或 PCR 扩增的方法来制备。（如果线性化不彻底，将会导致阴性克隆的产生，推荐使用双酶切或 PCR 扩增的方法。）
二、 DNA 片段的制备：
1.   DNA 片段可通过 PCR 扩增或酶切的方法制备，PCR 扩增片段无需纯化即可用于重组反应。
2.   PCR 扩增法引物设计原则：引物的 3 ’端必须包含 18-50 个能与模板 DNA 结合的碱基序列，以便 PCR 扩增出目的 DNA 片段。引物的 5 ’端必须包含 15-80 个与线性化载体末端同源的碱基序列，以便 PCR 扩增片段能与线性化载体进行重组反应。
三、重组反应：
3.   按照如下体系操作：
线性化载体                        50-100 ng
自备的 DNA 插入片段        X ng
2×无缝克隆 Mix               10 μL
超纯水                            补足至总体积为 20 μL
注意:目的片段与载体的摩尔比建议在 2:1-3:1 之间。
当插入片段总和>5 kb 的时候，可适当延长孵育时间到 30-50 min。
4.   50℃反应 20 分钟，然后将离心管放置于冰上 2 分钟。如当天不进行转化实验，请将连接产物放-20℃保存。
四、转化：
5.   取 4 μL 连接液至 50-100 μL 刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴 30分钟。
6.   42℃水浴热激 90 秒。
7.   立即放置于冰上静置 5 分钟。
8.   加入 500 μL 无菌 SOC 或 LB 培养基（不含抗生素），37℃ , 200-250 rpm 振荡培养 45-60 分钟。
9.   吸取 200 μL 菌液涂板，为得到更多克隆，可先 4000 rpm 离心 3 分钟，弃掉部分上清，用移液器轻吹菌体，至充分悬浮，取全部菌液涂板，然后 37℃ 培养过夜（ 12-16 小时）。
10. 用菌落 PCR、直接测序或其他方法鉴定重组子。
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