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ATPase 活性测定试剂盒（比色法）说明书

发布时间：2025/4/17 15:34:18 阅读次数：15

CAT#:JW-7-230703 常温运输和保存

ATPase 活性测定试剂盒（比色法）

产品及特点
P-type ATPase 是非常重要的一类细胞膜蛋白，又叫离子泵（Ion Pump）或磷脂转运酶（Lipid Flippase），它参与形成 Na+、K+、H+等多种重要离子的电位梯度形成和脂肪分子的非对称分布，而这两者是很多非常基础的细胞活动的基础（如神经活动），它们耗费细胞 1/3 以上的能量，在脑中耗费甚至高达 70%，因此是非常重要的研究课题。P-type ATPase 的活性检测是研究此酶和此酶相关促进剂和抑制剂的重要手段，其活性可以通过检测磷脂转运、检测离子跨膜运输和检测 ATP 水解等多种方法达成。本产品就是基于 ATP 水解的比色检测法开发的试剂盒，它具有以下特点：
1.   即开即用，不需要用户单独准备所有溶液。
2.   适合于包括 P-type ATPase 在内的各种 ATPase 等。
3.   样本中不得有其他 ATP 水解酶的污染。
4.   提供标准品，能检测到 nmol 级别的 ATP 水解，可以测到浓度为 0.005U/L得 ATPase。
5.   本产品也可以用于无机磷的检测。
6.   足够 100 次 1mL 比色皿测定，或足够至少 200 次或更多次微孔板测定。
7.   本产品只能用于科研。
8.   本试剂盒 1 个单位 ATPase 的定义是在 25℃ pH7.5 的条件下， 1 分钟能释放 1umol 磷酸所需的酶量。

规格及成分
第一部分：ATP 活性测定试剂盒常温成分，7-230703pt1 ，小扁盒包装

成分                                    编号                    规格               包装
ATPase 显色液成分 1        7-230703b1      25 mL      30 mL 本色瓶
ATPase 显色液成分 2        7-230703b2      75 mL      120 mL 本色瓶
ATPase 显色液成分 3        7-230703b3      4 mL       5 mL 本色瓶
ATPase 显色终止液           7-230703c        10 mL      10 mL 本色管
10mM 磷酸标准品              7-230703d        0.5 mL     0.5 mL 白盖管
使用手册                      7-230703sc       1份                无

第二部分：ATP 活性测定试剂盒低温成分，7-230703pt2 ，塑料袋包装
成分                                    编号                规格      包装
无底物 ATPase 反应液    7-230703a        5 mL      5 mL 本色瓶
ATPase 底物干粉       7-230703b   100 次       0.5mL 本色管

运输及保存：常温运输和保存，保质期 12 个月。
自备物品：1.5 毫升离心管、分光光度仪。

使用方法    一、制备待测样品（本试剂盒不含相关试剂）
1.   按自选方法制备 ATPase 样本，此蛋白是膜蛋白。
2.   测定膜蛋白浓度，此数据将用于计算P-type ATPase 的比活。
3.   将膜蛋白浓度调到 500ug/mL ，放冰上待用。
4.   制备 ATPase 样本时需要加上所需要得对照。
5.   如果使用细胞裂解液作为样本，需要用无底物 ATPase 反应液作为匀浆液。得到的裂解液可能有内源磷酸盐的干扰，需要先予以去除。
二、新鲜配制下列溶液待用
6.   含底物的 ATPase 反应液： 1 次 1mL 比色皿测试需要 0.1mL 含底物的 ATPase 反应液。如果有 N 个样本，则需要做 N+2 次反应，其中 1 个无 ATPase 对照，一个是有 ATPase 对照（如果无此对照，可以不做），故共需要（N+2）×0.1mL 的含底物的 ATPase 反应液。如果需要做 N 次重复，则配制的体积×N。假设需要配制 1mL，则将 1 mL 无底物的 ATPase 反应液和 10uL ATPase 底物溶液含底物的 ATPase 反应液，放冰上待用。注意：首次使用 ATPase 底物时在 ATPase 底物干粉管中加入 1mL 超纯水，涡旋20 秒混合即得 ATPase 底物溶液。该溶液需要分装成小管放-20℃ , 避免反复冻融。
7.   无底物的 ATPase 反应液：试剂盒提供，所需体积同上步，直接放冰上待用。
8.   ATPase 反应显色液： 1 次 1mL 比色皿测试需要 0.8mL ATPase 反应显色液。如果有个样本，则需要做 N+2 个含底物的 ATPase 反应和 N+2 个无底物的 ATPase 反应（见上述两步），还需加 1 个无显色液对照和 5 个显色标曲样本，共需要（2N+10） ×0.8mL 的 ATPase 反应显色液。假设需要配制 10 mL，则将 7.5mL 的 ATPase 反应显色液成分 1 和 ATPase 反应显色液成分 2 混合，脱色摇床上摇晃 30 分钟，用针头过滤器过滤，加入 0.4mL ATPase 反应显色液成分 3 摇晃 5 分钟混匀，得 ATPase 反应显色液。放冰上待用。
9.   标曲样本：将 10uL10mM 磷酸标准品加入到 990uL 超纯水中，涡旋震荡
30 秒得到 100uM 磷酸溶液，分别将 0、 10、20、30、40、50uL 此溶液加入到标注为 0-5 的 6 个 1.5mL 塑料管中，分别加入 200uL、 190uL、 180uL、 170uL、 160uL 和 150uL 的无底物 ATPase 反应液，涡旋震荡 30 秒后放冰上待用。0-5 号管中的磷酸 nmol 数分别为 0、 1、2、3、4、 5nmol。此将在制作标准曲线时作为横坐标。
三、ATPase 反应和显色反应（分别为 0.2mL 体系和 1mL 体系）
10. 按下表完成 ATPase 反应（如果每个样品做 1 次重复，共 2N+4 个反应）：
                                                        A 组：有底物                                                         B 组：无底物
成分                                N 个样本管       有酶对照管     无酶对照管        N 个样本管      有酶对照管      无酶对照管
N 个待测样本 0.1mL                   加                                                                    加
确认含ATPase 的样本 0.1mL                            加                                             加
水 0.1mL                                                            加                                   加
含底物的ATPase 反应液 0.1mL    加      加                   加
无底物的ATPase 反应液 0.1mL                                       加                    加                 加
                                                                  25℃30 分钟
11. 按下表完成显色反应（如果每个样本做 1 次重复，共 2N+11 个反应）。A 组和 B 组的 2N+4 个样本可以直接在上步的管中进行后续操作：
成分                      A 组 N+2 个样品管      B 组 N+2 个样本管          无显色液对照管     0-5 号标曲样本管
来于上步的反应样本            各 0.2mL           各 0.2mL
无底物ATPase 反应液                                                    0.2mL
6 个标准曲线样本第 8 步制备                                               按对应编号各 0.2 mL
ATPase 反应显色液               各 0.8 mL              0.8 mL                0.8 mL                    各 0.8 mL
        混匀后溶液立即呈现鲜绿色， 1 分钟后立即进入下一步
ATPase 反应终止液           各 0.1 mL               0.1 mL             0.1 mL          各 0.1 mL
        混匀后 25℃放置 30 分钟，660nm 测吸光值。以水校零
四、数据分析
12. 如果所有样本包括有酶对照管和标曲都没有读数，则整个实验无效。
13. 如果无酶对照管、无显色液对照管读数高于有酶对照管和标曲，则实验无效，联系厂家。
14. 如果有酶对照管和标曲有读数，无酶对照管、无显色液对照管读数分别低于有酶对照管和标曲，则整个实验有效，可以继续分析 N 个待测样本的结果。
15. 将标曲的所有读数都减去无显色液对照的读数，然后绘制标准曲线。纵坐标是 OD660 读数，横坐标是磷酸盐标准品的 nmol 数。
16. 将每个测样本的有底物测试数值减去这个样本的背景读数（背景读数是从该样本的无底物测试读数和整个实验的无显色液对照读数中，选最高的一个而得）得到有效读数，用此有效读数从标准曲线上推算出该样本释放的磷酸的 nmol 数。
17. 如果样本的 OD660 数值在标曲范围之外，则需要稀释样本，直到其数字在标曲范围之内。具体稀释多少倍，需要自行摸索。
18. 根据样本释放磷酸的 nmol 数，按下面的公式计算 ATPase 的活性。待测样本 ATPase 的活性（U/mL）=(磷酸释放 nmol 数*稀释倍数)/(ATPase 反应时长 30 分钟*ATPase 反应加入的样本微升数)。如果样本没有稀释，则稀释倍数为 1。
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