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2×探针法 Tth qRT-PCR MasterMix 说明书

发布时间：2025/4/17 15:43:00 阅读次数：20

CAT#:990505-1低温运输，-20℃保存

2×探针法 Tth qRT-PCR MasterMix

产品及特点
本产品是基于 Tth DNA 聚合酶的荧光探针法 RT-PCR MasterMix ，它含有经过优化的缓冲液组分、Tth DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2 等所有实时定量 RT-PCR 所需要的成分。与常用的 MMLV-Taq DNA 酶 RT-PCR 体系相比，它们的区别如下：

本产品具有下列特点：
1.   方便，用户只需准备模板、引物和探针即可以进行探针法 qRT-PCR 实验。
2.   产品为 2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3.   60-70℃进行 RT-PCR ，避免了 RNA 二级结构打不开问题和非特异扩增问题。
4.   各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
5.   本规格有 1mL ，足够 100 次 20uL 体系的探针法荧光定量 RT-PCR。
6.   比进口同类产品性价比更高。
7.   本系列产品只可用于科研。

规格及成分                                 本产品采用塑料袋包装
成分                                                        编号        规格          包装
2×探针法 Tth qRT-PCR MasterMix 990505   1 mL    1.5mL 棕色管
使用手册                                               990505sc    1 份         无

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为 12 个月。
自备试剂：待测 RNA 模板、阳性对照 RNA 模板、引物、探针、超纯水。

使用方法 1.   按下表设置探针法 Tth qRT-PCR 反应，以一个样本为例：
成分                                                    样品管    阴性对照    阳性对照
2×探针法 Tth qRT-PCR MasterMix       10 μL      10 μL       10 μL
自备引物 1 和引物 2（ 10μM each）    各 1μL    各 1μL      各 1μL
TaqMan 探针（ 5μM）                           1μL         1μL            1μL
自备模板 RNA（ 100ng-1μg）          1-2μL
阳性对照 RNA 模板（ 100ng-1μg）           1-2μL
补超纯水到                                             20μL          20μL   20μL
2.   放入荧光 PCR 仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一般需要根据靶分子长度，引物的 Tm值等进行调节。一般选择三步法 PCR：
步骤                                 温度          时间
逆转录（ RT 步骤）    60-70℃    30 min（具体温度根据引物 Tm 决定）
预变性          95℃    3 min
PCR（ 35-45 次循环） 95℃       15 sec
       55-65℃    15-30 sec
                                      72℃   30 sec（根据探针的荧光标记选择对应的荧光通道）
如果引物 Tm值接近 60℃ , 也可以选择两步法 PCR：

步骤            温度         时间
逆转录（ RT 步骤）        60-70℃    30 min（具体温度根据引物 Tm 决定）
预变性                              95℃        3 min
PCR（ 35-45 次循环）    95℃       15 sec
           60℃      60 sec（根据探针的荧光标记选择对应的荧光通道）
3.   定量分析数据处理：以 6 个 10 倍稀释的标准曲线样本的浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 DNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
4.   定性分析数据处理：阴性对照 Ct 大于或等于 40（此处为便于叙述姑且以 40 为例，具体设置成多少需要用户根据引物探针的具体情况测试确定）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 40 。如果对照结果不能满足上述条件，则实验无效，不需要分析待测样本数据。如果满足上述条件，表示实验有效，则可以继续分析待测样本。对待测样品，如果其 Ct 大于或等于 40 则为阴性，如果小于 40 则为阳性。
关联产品    染料法 Tth qRT-PCR 试剂盒