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磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒说明书微量法

发布时间：2025/5/21 11:06:13 阅读次数：9

磷酸果糖激酶（PFK）活性检测试剂盒说明书微量法

注意：本产品试剂有所变动，请注意并严格按照该说明书操作。
产品组成：使用前请认真核对试剂体积与瓶内体积是否一致，有疑问请及时联系工作人员。

试剂名称        规格    保存条件
提取液    液体 110 mL×1 瓶    2-8℃保存
试剂一    液体 20 mL×1 瓶    2-8℃保存
试剂二 A    粉剂×1瓶        -20℃保存
试剂二 B    粉剂×1支        -20℃保存
试剂二 C    粉剂×2 支        -20℃保存
试剂二 D    粉剂×1支        -20℃保存
试剂三    液体 25μL×1 支    2-8℃保存
试剂四    液体 10μL×1 支    2-8℃保存

溶液的配制：
1 、试剂二 A：临用前加入 1mL 蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
2 、试剂二 B：临用前加入 1mL 蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
3 、试剂二 C：临用前取一支加入 0.5mL 蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存 2 周，避免反复冻融；
4 、试剂二 D：临用前加入 1mL 蒸馏水，用不完的试剂-20℃分装保存 4 周，避免反复冻融；
5 、试剂三：临用前根据用量按照试剂三:蒸馏水为 1μL:50μL（约5T）的体积比例充分混匀，现用现配；
6 、试剂四：临用前根据用量按照试剂四:蒸馏水为 1μL:125μL（约 12T）的体积比例充分混匀，现用现配；
7 、工作液的配制：根据样本量按试剂一：试剂二 A：试剂二 B：试剂二 C：试剂二 D =8mL：0.5mL：0.5mL： 0.5mL：0.5mL（约 55T）的比例配制工作液，现用现配。

产品说明：
磷酸果糖激酶（Phosphofructokinase ，PFK ，EC 2.7.1.11 ）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖二磷酸和 ADP ，是糖酵解过程的关键调节酶之一。
PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖-二磷酸和 ADP，丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化 NADH 氧化生成 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PFK 活性。

注意：实验之前建议选择 2-3 个预期差异大的样本做预实验。如果样本吸光值不在测量范围内建议稀释或者增加样本量进行检测。

需自备的仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅/恒温培养箱、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔 UV 板、研钵/匀浆器/细胞超声破碎仪、冰和蒸馏水。

操作步骤：
一、样本处理（可适当调整待测样本量，具体比例可以参考文献）
1.     细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500-1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 200W，超声 3s，间隔 10s ，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min ，取上清，置冰上待测。
2.     组织：按照组织质量（g）：提取液体积（mL）为 1:5-10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3.     血清（浆）等其他液体：直接检测。若有沉淀请离心后取上清待测。
二、测定步骤
1.     紫外分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm ，分光光度计蒸馏水调零。
2.     工作液临用前于 37℃预热 10min。
3.     操作表：

试剂名称(μL）    测定管
样本        10
试剂三        10
试剂四        10
工作液        170
将上述试剂按顺序加入微量石英比色皿或 96 孔 UV 板中，立即充分混匀后于 340nm 处测定 20s 时的吸光值 A1，迅速置于 37℃准确反应 10min（酶标仪有控温功能可将温度调至 37℃) ,拿出迅速擦干测定 10min20s 时的吸光值 A2。计算 ΔA=A1-A2。

三、PFK 活性的计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下：
1、血清（浆）PFK 活性的计算：
单位的定义：每毫升血清（浆）在反应体系中每分钟催化 1nmol NADH 转化为 1nmol NAD+定义为一个酶活性单位。
PFK 活性（U/mL）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×109] ÷V 样÷T=321×ΔA
2、组织、细菌或细胞中 PFK 活性的计算：
（1）按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol NADH 转化为 1nmol NAD+定义为一个酶活性单位。
PFK 活性（U/mg prot）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×109] ÷(Cpr×V 样)÷T=321×ΔA÷Cpr
（2）按样本质量计算
单位的定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol NADH 转化为 1nmol NAD+定义为一个酶活性单位。
PFK 活性（U/g 质量）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×109] ÷(W×V 样÷V 样总)÷T=321×ΔA÷W
（3）按细菌或细胞数量计算
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol NADH 转化为 1nmol NAD+定义为一个酶活性单位。
PFK 活性（U/104 cell）=[ΔA×V 反总÷ (ε×d）×109] ÷(N×V 样÷V 样总)÷T=321×ΔA ÷N
V 反总：反应体系总体积，2×10-4L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间， 10min；Cpr：样本蛋白质浓度， mg/mL；W：样本质量，g；N：细菌或细胞总数，以万计；109：单位换算系数，1mol=109nmol。
b.用96 孔板测定的计算公式如下：
将上述公式中的 d-1cm 改为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。

注意事项：
1.     测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置，以免变性和失活。
2.     比色皿中反应液的温度必须保持 37℃,取小烧杯一只装入一定量的 37℃蒸馏水，将此烧杯放入 37℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3.     最好两个人同时做此实验，一个人比色，一个人计时，以保证实验结果的准确性。
4.     不同匀浆组织中PFK 活性不一样，若 ΔA>0.5，则说明活性太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液，或缩短反应时间至 2min 或 5min，使 ΔA<0.5 ，以提高检测的灵敏度。注意同步修改计算公式。

实验实例：
1 、取 0.1g 黑麦草加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A1-A2=1.6086-1.2986=0.31，按样本质量计算酶活得：
PFK 活性（U/g 质量）=535×ΔA÷W=535×0.31÷0.1=1658.5 U/g 质量。
2 、取 0.1g 桃叶加入 1mL 提取液进行匀浆研磨，取上清之后按照测定步骤操作，用微量石英比色皿测得计算 ΔA=A1-A2=1.7025-1.6159=0.0866，按样本质量计算酶活得：
PFK 活性（U/g 质量）=535×ΔA÷W=535×0.057÷0.1=463.31 U/g 质量。

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