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诺氟沙星（Norfloxacin） ELISA 检测试剂盒使用说明书

发布时间：2025/5/21 11:22:20 阅读次数：21

诺氟沙星（Norfloxacin） ELISA 检测试剂盒使用说明书

检测原理
试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被诺氟沙星（Norfloxacin）抗原的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP 标记的竞争抗原，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的诺氟沙星（Norfloxacin）呈负相关。用酶标仪在450nm 波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。
样品收集、处理及保存方法
1.    样本不能含叠氮钠（NaN3），因为叠氮钠（NaN3）是辣根过氧化物酶（HRP）的抑制剂。
2.    标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行。
3.    植物萃取液或其它相关样本：请1000 x g离心20分钟，取上清即可检测。花生样本处理方法：样本去壳粉碎，称取5g于100ml具塞三角瓶中，加入25ml 60%甲醇谁溶液和20ml正乙烷振荡10min，滤纸过滤，弃去1/4初滤液，收集其余滤液于125ml分液漏斗中，静置分层后放出下层60%甲醇水提溶液。现提取液2ml ，加入2ml超纯水稀释，使提取液甲醇浓度为30%，此为样品代测液。
4.    保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于 -20℃ ,   避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品
1. 酶标仪（450nm）
2. 高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒温箱

操作注意事项
1.      试剂盒保存在 2-8℃ ,    使用前室温平衡 20 分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解
后再使用。
2.      实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
3.      按照说明书操作时样本已经稀释 5 倍，最终结果乘以 5 才是样本实际浓度。
4.      严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。
5.      所有液体组分使用前充分摇匀。试剂盒组成

名称        96孔配置        48孔配置        备注
微孔酶标板    12孔×8 条    12孔×4 条    无
标准品        0.3mL *6 管    0.3mL *6 管    无
样本稀释液    6mL        3mL        无
竞争抗原-HRP    6mL        3mL        无
20×洗涤缓冲液    25mL        15mL        按说明书进行稀释
底物 A        6mL        3mL        无
底物 B        6mL        3mL        无
终止液        6mL        3mL        无
封板膜        2 张        2 张        无
说明书        1 份        1 份        无
自封袋        1 个        1 个        无
注：标准品（ S0-S5）浓度依次为：0 、0.375 、0.75 、 1.5 、3 、6 ppb

试剂的准备
20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按 1：20 稀释，即 1 份的 20×洗涤缓冲液加 19 份的蒸馏水。
洗板方法
1. 手工洗板：甩尽孔内液体，每孔加满洗涤液，静置 1min 后甩尽孔内液体，在吸水纸上拍干，如此洗板 5 次。
2. 自动洗板机：每孔注入洗液 350 μ L，浸泡 1min，洗板 5 次。

操作步骤
1. 从室温平衡 20min 后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回 4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品 50 μ L；
3.样本孔先加待测样本 10 μ L，再加样本稀释液 40 μ L；空白孔不加。
4. 除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（ HRP）标记的竞争抗原 50 μ L，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育 60min。
5. 弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置 1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板 5 次（也可用洗板机洗板）。
6. 每孔加入底物 A 、B 各 50 μ L，37℃避光孵育 15min。
7. 每孔加入终止液 50 μ L ，15min 内，在 450nm 波长处测定各孔的 OD 值。

结果判断
1. 15分钟内在波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值；
2. 百分结合率计算：设S0管计数为B0，各标准管或样品管计数为B，非特异管计数为 NSB ，则百分结合率计算公式如下： B/B0=(B -   NSB)/(B0－NSB)×100%
3. logit 计算 :   各标准点或样品管的 logit 值计算公式   如下:logit=ln(B/B0)/(1－B/B0)
4. 将标准品的OD均值与标准品0点的OD均相除，为标准点的百分结合率，在log-logit坐标纸上绘图。
5. Log-logit双对数标准曲线：坐标纸上横轴从左至右第一个1-9表示为第一个10进位，第二个1-9表示为第二个10进位。第三个1-9表示为第三个10进位。坐标纸纵轴为百分比（1-99），即各标准吸光值的百分结合率。取一条通过各点的直线。要求尽可能多的点在线上，同时剩余的点均匀分布在直线的两边。样品也同样由吸光值计算百分结合率，再从纵轴上的相应结合率找到直线上的点，此点对应的横坐标浓度即为样品的浓度，无须换算。
6. 人工处理：以标准浓度取log值为横坐标，对应的logit值为纵坐标在普通坐标纸上或以标准浓度为横坐标，对应的B/B0为纵坐标在 logit-log坐标纸上画出标准曲线（理想化时是一条直线）。根据待测样品的B/B0可以从坐标纸上查出样品的浓度值。如果使用普通坐标纸，查出的数值应取反对数才是最后的浓度值。
7. 自动处理：使用logit-log或四参数数据处理模式，由电脑自动计算得出结果。
8. 敏感度：0.25 ppb
9. 图例

试剂盒性能
1.      准确性：标准品线性回归与预期浓度相关系数 R 值，大于等于 0.9900。
2.      灵敏度：最低检测浓度小于 0.25ppb。
3.      检测范围: 0.1 - 6 ppb。
4.      特异性：不与其它可溶性结构类似物交叉反应。
5.      重复性：板内、板间变异系数均小于 15%。
6.      贮藏：2-8℃ ,    避光防潮保存。
7.      有效期：6 个月

免责声明
1.      试剂盒仅供研究使用，不得用于临床实验或人体实验，否则所产生的一切后果，由实验者承担，本公司概不负责。
2.      严格按照说明书操作，实验者违反说明书操作，后果由实验者承担。