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ELISA实验常见问题分析

发布时间：2025/6/26 10:40:55 阅读次数：37

问题一：高背景或阴性对照值偏高
可能原因及建议
1、阴性对照孔被阳性对照或样品污染
建议：洗涤时，勿将洗液溢出孔外。
2、洗涤不充分
建议：确保在洗涤时每个孔都充满了液体，确保将残余液体从孔中移除。
3、酶结合物过浓
建议：请检查酶结合物是否按说明书规定稀释
4、孵育温度过高
建议：检查孵育箱的温度是否正确、稳定
5、底物在使用前曝光
建议：应保存在暗处，避光。
6、读板前停留时间过长
建议：加终止液后 3 分钟内读数

问题二：阳性对照值偏低或低吸光度
可能原因及建议
1、试剂未平衡至室温
建议：开始实验前，将试剂盒平衡至室温
2、包袋中有湿气
建议：首次开袋标上日期，封好未使用的孔条，放入干燥剂。
3、样本中有抑制剂
建议：叠氮化钠抑制 HRP 的活性
4、试剂在使用前未混匀
建议：使用前混匀试剂
5、洗涤步骤过于剧烈
建议：降低洗涤系统的压力
6、实验开始后，微孔变干燥
建议：实验过程勿中断，应连续完成所有的实验步骤。
7、检测体积偏小
建议：确保移液器已校正

问题三：边缘效应
可能原因及建议
1、蒸发    各步之间，
建议：须使用封版胶密封反应板。
2、温度不均匀
建议：校准孵育箱，勿叠放反应板。

问题四：标准曲线不佳
可能原因及建议
1、倍比稀释标准品时未混匀
建议：稀释标准品的每一步均需混匀
2、过早稀释
建议：标准品在快要使用时稀释
3、加入的体积不正确
建议：使用校准过的移液器，快速、等量的将标准品分配到各个微孔中。

问题五：标准曲线良好，但样本无检测信号
可能原因及建议
1、样本中无检测物或检测物含量极低
建议：设置内参，重新实验
2、样本中其他物质影响/ 掩盖检测
建议：作适当稀释，降低其他物质的干扰，或作系列稀释，检测回收率。
3、样本中检测物浓度过高，Hook 效应导致假低值
建议：适当倍数稀释样本，检测物浓度尽量在试剂盒检测范围内。

问题六：重复性较差
可能原因及建议
1、微孔中有气泡
建议：用针尖挑破气泡
2、试剂未混匀
建议：确保充分混匀试剂
3、样本中有杂质或沉淀物
建议：使用前离心
4、微孔包被面被吸头划破
建议：加液时小心操作
5、使用用过的封板胶纸
建议：每次须使用新的封板胶封住反应孔