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细胞收货当天操作指南

发布时间：2025/6/26 11:01:32 阅读次数：25

【收货当天操作指南】
一、运输方式：
1.干冰运输：1mL冻存管干冰运输，及时拍照记录有无管壁破损现象，完好立即转入-80度冰箱保存过夜，再转入液氮保存或直接复苏，若发现干冰已挥发干净、冻存管瓶盖脱落、破损，请立即与我们联系。
2.T25瓶复苏的存活细胞常温发货，收到后及时拍照记录有无漏液/瓶身破损现象，用70%酒精消毒细胞培养瓶各个表面后，满瓶培养基状态置于培养箱中静置培养2~4h 后进行操作；悬浮细胞请将培养瓶竖立在培养箱静置，贴壁细胞/半贴壁半悬浮细胞平放静置，在此期间，请查看说明书以确定细胞属性。请拍4X、10X、 20X 各 2-3 张照片作为售后时收到时细胞状态的依据。
2.1.细胞密度为80%左右时需传代。
2.2.细胞密度小于70%且无细胞脱落情况下，吸除全部培养基，瓶内加入5毫升新鲜培养液，继续培养。 (灌装培养基是完全培养基可以直接保留5ml继续培养）。

二、传代培养：
细胞已长满（达 85-95%）。即可进行传代，具体步骤如下：
1.弃去培养液，用PBS洗涤1-2次；
2. 将Trypsin-EDTA.(0.05%) (极威生物货号：JW-CSP048)、细胞完全培养基、终止液/含10%FBS其它培养基（用于终止液）置于室温平衡。
3. 弃去培养瓶中培养基，用5ml无钙镁离子PBS缓冲液（极威生物货号：JW-1300）清洗细胞层，尽量去除液体后加入1ml的0.05%胰酶消化液 37℃消化1~3min至细胞变圆（建议每隔1min在显微镜下观察细胞的消化情况），用手轻拍瓶尾成流沙样脱落 ; 脱落率约80%。
4. 此时,立即加入3-5ml终止液/其他完培培养基（含10%血清）终止消化,轻柔吹打瓶内3-6下,将细胞悬液转移到15ml离心管,约200g(1000-1200rpm)室温离心5min ;
5. 弃上清，用手指弹松细胞细胞沉淀，加入新鲜完全培养基后视推荐传代比例(首次建议1：2传代)和细胞计数后进行接种若干新的T25培养瓶中；培养基t25添加5-7ml ;
6.每2天更换一次培养基。

三、冻管细胞复苏:
1、提前室温细胞完全培养基。
2、准备一个培养瓶，添加5ml室温平衡完全培养基，同时准备一个15mL离心管,添加5ml含10%血清的其他培养基（用于离心）。
3、将冻存管快速在37℃水浴槽中解冻细胞，至细胞完全融化 (请在1-2分钟内完成）
4、立即取出冻存管，75%乙醇擦拭消毒冻存管表面，转移至生物安全柜，将细胞悬液加入到提前准备好的离心管里。
5、在室温，200g (1000-1200rpm)离心5min。
6、弃去上清，用手指弹松细胞沉淀，添加2ml完全培养基重新悬浮细胞后，接种至1个T25培养瓶中，培养瓶中总共完培5-7ml 。“ 画8字法 ”使细胞均匀分布。
7、在 37℃ 、5% CO2 和 95%空气条件下进行细胞培养，透气瓶可直接放入培养箱 , 非透气请拧松放入培养箱。
8、在复苏后第二天16h后可观察贴壁情况，有少量漂浮可以不用换液，约2-4天可进行传代。

四、细胞冻存步骤：
1.细胞密度80%以上，活细胞百分率达95%以上时，将细胞按照以上步骤进行消化收集细胞沉淀进行冻存。
2.细胞沉淀用适量4°C冻存液（货号：JW-CSP042）重悬，建议一瓶T25细胞冻存一管（1ml/管），直接将分装好的细胞冻存管置于-80℃超低温冰箱中过夜，若需液氮长期保存，需先置于-80℃至少一天后方可转至液氨罐中。
NOTE:若不是我司冻存液请按照冻存液说明书操作，若是自配冻存液需梯度降温冻存(2-8℃，放置 40min:-20℃,放置 30min-60min，-80℃放置一天后转移至液氮保存)或使用程序降温盒降温后，再转移至液氮中保存。