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漆酶活性检测试剂盒说明书微量法

发布时间：2025/7/2 15:01:03 阅读次数：24

漆酶活性检测试剂盒说明书微量法
注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

规格：100T/96S
产品内容：
提取液：液体 110mL×1 瓶，4℃保存。试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。试剂二：粉剂×2 瓶，4℃避光保存。

产品说明：
漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，漆酶存在菇、菌及植物中，是一种环保型酶，其独特的催化性质在生物检测中有广泛的应用。
漆酶分解底物 ABTS 产生 ABTS 自由基，在 420nm 处的吸光系数远大于底物 ABTS，测定 ABTS 自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。

试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计/酶标仪、低温离心机、微量玻璃比色皿/96 孔板、可调式移液枪、天平、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水，水浴锅。

操作步骤：
一、粗酶液提取：
1.组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入
1mL 提取液），进行冰浴匀浆。10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2.细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。
3.培养液：直接检测。二、测定步骤：
1、分光光度计/酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 420nm，分光光度计蒸馏水调零。
2、水浴锅温度调至 45℃。
3、工作液的配制：一瓶试剂二用 10mL 试剂一溶解。现用现配。
4、操作表：在微量玻璃比色皿/96 孔板中分别加入下列试剂：
样本名称        测定管    空白管
样本（μL）    30
蒸馏水（μL）    -    30
工作液（μL）    170    170
在微量玻璃比色皿/96 孔板中分别加入上述试剂，充分混匀后于 420nm 处测定 10s 时的吸光值

三、漆酶活计算
1.按微量玻璃比色皿计算：
1.按蛋白浓度计算
酶活定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反总×109÷（V 样×Cpr）÷T= 61.7×△A÷Cpr
2.按样本质量计算
酶活定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/g 鲜重）=△A÷ε÷d×V 反总×109÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 61.7×△A÷W
3.按细胞数量计算
酶活定义：每 104 个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/104 cell）=△A÷ε÷d×V 反总×109÷（V 样×500÷V 样总）÷T= 0.123×△A
4.按液体体积计算
酶活定义：每 mL 液体每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。漆酶酶活（U/ mL）=△A÷ε÷d×V 反总×109÷V 样÷T= 61.7×△A
ε：ABTS 摩尔消光系数：36000L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，2×10-4L； V 样：反应中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定；W，样本质量，g；T：反应时间，3min。
2.按 96 孔板计算：
将上述计算公式中的 d-1cm 换为 d-0.6cm（96 孔板光径）进行计算即可。
注意事项：
1.工作液需临用前配制，并且尽快使用，4℃保存一周，若变色则不能使用。
2.测定之前进行预实验，若吸光值较高，请将样品用提取液进行适当的稀释再测定，并在计算公式中乘以稀释倍数。
3.空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，OD 值变化不超过 0.05。