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考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书微量法

发布时间：2025/7/2 15:19:14 阅读次数：33

考马斯亮蓝法测蛋白含量测定试剂盒说明书微量法

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。
规格: 100T/96S

产品内容：
试剂一：液体25mL×1 瓶，4℃保存。
标准品：500μg/mL×1 瓶，4℃保存，临用前用蒸馏水稀释为50μg/mL。

产品说明：
样品可溶性蛋白质含量常常用于酶活性计算。此外，可溶性蛋白质含量也用于食品等质量分析。在酸性溶液中，考马斯亮蓝G-250 与蛋白质结合形成蓝色复合物：该复合物在595nm处有最大吸
收峰。其颜色的深浅与蛋白质的浓度成正比。该方法灵敏度高，适合微量蛋白质分析。

自备仪器和用品：
紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、移液器和蒸馏水。

操作步骤：
一、样品中可溶性蛋白质提取
1.   液体样品：澄清无色液体样品可以直接测定。
2.   组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~ 10 的比例（建议称取约0. 1g组织，加入 1mL 提取液（自备，根据需要选用酶提取缓冲液或者蒸馏水或者生理盐水））。冰浴匀浆，
10000rpm ，4℃离心10min ，取上清，即待测液。（动物样品常常需要稀释）
3.   细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~ 1000：1 的比例（建议500 万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率300w ，超声3 s ，间隔7s ，总时间3min）；然后 10000rpm ，4℃ , 离心10min ，取上清置于冰上待测。

二、吸光值测定
1.   分光光度计预热30 min 以上，蒸馏水调零。
2.   空白管：取0.5 mL EP管，加入40μL 蒸馏水，250μL 试剂一，混匀后室温静置10min ，取200μL 于微量玻璃比色皿/96孔板，595nm 比色，10~20min 完成比色，记为A 空白管。
3.   标准管：取0.5 mL EP管，加入40μL 标准液，250μL 试剂一，混匀后室温静置10min ，取200μL 于微量玻璃比色皿/96孔板，595nm 比色，10~20min 完成比色，记为A 标准管。
4.   测定管：取0.5 mL EP管，加入40μL 待测液，250μL 试剂一，混匀后室温静置10min ，取200μL 于微量玻璃比色皿/96孔板，595nm 比色，10~20min 完成比色，记为A 测定管。

三、蛋白质含量：
C 待测 (μg/mL）=50×(A 测定管-A 空白管)÷(A 标准管-A 空白管) C 标准管：标准品蛋白质浓度，50μg/mL。
注意事项：
1.   加考马斯亮蓝后，在10~20min 内吸光值相对较稳定，因此须在10~20min 完成比色。
2.   不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，测完成后立即用95%乙醇冲洗。
3.   测定前用1~2 个样做预实验，确保蛋白浓度在0~ 100μg/ml 范围内，否则需要做相应稀释。