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细菌 DNA 损伤彗星完全荧光检测试剂盒产品说明书

发布时间：2025/7/3 9:41:38 阅读次数：36

细菌 DNA 损伤彗星完全荧光检测试剂盒产品说明书

主要用途
细菌 DNA 损伤彗星（Comet）完全荧光检测试剂是一种旨在采用细菌细胞中性凝胶电泳，在电场环境下，损伤变性的 DNA 片段迁移形成特定的形态，即 DNA 移动尾巴，来进行体外评价和半定量分析 DNA 损伤程度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于新鲜细菌细胞的 DNA 损伤研究，包括 DNA 链断裂、氧化性碱基损伤、DNA 剪切损伤、DNA 交联、DNA 修复等，应用于环境和药物毒理学、放射学、氧化应急反应、抗生素敏感性等研究。产品严格无菌，即到即用，性能稳定，操作简便，重复一致。

技术背景
彗星检测技术（Comet assay），又称为单细胞凝胶电泳检测技术（single cell gel electrophoresis assay；SCGE）或微凝胶电泳检测技术（microgel electrophoresis assay），是基于变性切离的DNA片段，在电场的影响下，从细胞中移出的原理，而完整的超螺旋DNA仍然保持在细胞核内。通过凝胶电泳，呈现出分子迁移图形，形成彗星拖尾（comet tail）现象，即完整DNA的细胞染色体为“头” ，而松散和断裂的DNA为“尾” ，以此评价DNA损伤程度。这是分析单一细胞DNA链断裂的敏感方法之一。其技术方法的基本步骤是：第一，细胞固定包埋在凝胶里；第二，细胞裂解处理；第三，DNA变性处理；第四，电泳迁移；第五，染色和图像分析。由此观察DNA迁移形态，进行体外检测，成为细胞DNA损伤研究的基本手段。

产品内容
胶体液（Reagent A）        毫升
基质液（Reagent B）        毫升
酶解液（Reagent C）        微升
裂解液（Reagent D）    毫升
解构液（Reagent E）        毫升
电泳液（Reagent F）        毫升
中和液（Reagent G）    毫升
染色液（Reagent H）    毫升
产品说明书        1 份

保存方式
保存酶解液（Reagent C）和染色液（Reagent H）在－20℃冰箱里，避免光照；胶体液（Reagent A）和基质液（Reagent B）室温下保存；其余的保存在 4℃冰箱里；解构液（Reagent E）具有腐蚀性。注意操作安全；有效保证 6 月

用户自备
无离子水：用于稀释电泳缓冲液
磨砂载玻片和盖玻片：用于放置样品进行微凝胶电泳的器材

电泳槽：用于微凝胶电泳的装置
恒温培养箱：用于孵育反应
1.5 毫升离心管：用于混匀基质液的容器
90 mm 细菌培养皿：用于样品处理、染色等的容器
荧光显微镜：用于观察细胞彗星现象

实验步骤
一、琼脂载玻片准备
1 ．准备 1 张完全磨砂载玻片，磨砂面朝上
2 ．将胶体液（Reagent A）置于微波炉里加热溶化（注意：避免溢出或干枯；参见注意事项4）
3 ．放进 45℃恒温水槽孵育 10 分钟
4 ．移出xx 微升胶体液（Reagent A）到载玻片中间
5 ．盖上洁净的盖玻片
6 ．轻压盖玻片 5 分钟，确保胶体液铺展
7 ．放进 4℃冰箱里直至胶体充分凝结

二、细胞准备
实验开始前，将基质液（Reagent B）置于微波炉里加热溶化（注意：参见注意事项4），然后放进 45℃恒温水槽备用。然后进行下列操作。
1 ．准备 1 管待测的新鲜培养细菌细胞（2 X 106 细菌/毫升）
2 ．移出20 微升菌液到 1.5 毫升离心管
3 ．加入 xx 微升在 45℃恒温水槽里的基质液（Reagent B）
4 ．用枪头上下抽吸混匀
5 ．用大拇指推动移走上述制备的载玻片上的盖玻片
6 ．即刻移取 75 微升细菌基质混合液到载玻片胶体上
7 ．用新的盖玻片盖上
8 ．轻压盖玻片 5 分钟，确保细菌基质混合液铺展
9 ．放进 4℃冰箱里冷却 10 分钟，直至胶体凝结，避免光照
10 ．移出xx 微升室温预热的酶解液（Reagent C）到 1.5 毫升离心管
11．加入 xx 微升在 45℃恒温水槽里的基质液（Reagent B）
12 ．用枪头上下抽吸混匀
13 ．用大拇指推动移走上述制备的载玻片上的盖玻片
14 ．即刻移取 200 微升酶解基质混合液到载玻片样品上面
15 ．用新的盖玻片盖上
16 ．轻压盖玻片 5 分钟，确保酶解基质混合液铺展
17 ．在 37℃温度下孵育30 分钟，避免光照（注意：同时确保胶体凝结）
18 ．再次用大拇指推动移走盖玻片
19 ．将载玻片放进 9cm细菌培养皿
20 ．加入 xx 毫升 4℃预冷的裂解液（Reagent D）
21 ．放进 4℃冰箱里孵育60 分钟
22 ．抽去裂解液
23 ．加入 xx 毫升解构液（Reagent E）
24 ．室温下孵育30 分钟，避免光照
25 ．小心抽去解构液

三、凝胶电泳
1 ．移出xx 毫升用户自备的电泳液（Reagent F）到 250 毫升三角烧瓶里
2 ．加入 xx 毫升用户自备的无离子水，充分混匀后，标记为电泳工作液
3 ．加入 xx 毫升电泳工作液到上述 9cm细菌培养皿
4 ．室温下孵育 5 分钟
5 ．倒去电泳工作液
6 ．重复实验步骤 3 至 5 一次
7 ．将载玻片置于（具有温度控制的）水平电泳槽里
8 ．加入适量的电泳工作液到电泳槽里，恰好在载玻片之上
9 ．插上电源，设定电压为 12 伏或电压 1.5 伏/厘米（根据电泳槽正负电极的距离）
10 ．在 4℃环境下，电泳 30 分钟（注意：可以延长时间，最大限度显示拖尾现象）
11．断开电源，取出载玻片
12 ．放进 9cm细菌培养皿
13 ．加入 xx 毫升用户自备的中和液（Reagent G）
14 ．在 4℃冰箱里孵育 5 分钟
15 ．倒去中和液
16 ．空气中晾干

四、染色分析
1 ．加上 xx 微升染色液（Reagent H）
2 ．盖上新的盖玻片
3 ．室温下孵育 15 分钟，避免光照
4 ．即刻在荧光显微镜油镜下观察并拍照记录：激发波长 480nm；散发波长 610nm 或紫外波长激发
5 ．室温下避光保存，如果重新观察，可以重复实验步骤 1 至 4
6 ．分析参数：
1）形态指标，即拖尾率目测计量（comet％）。根据荧光图像是否象彗星一样头尾分明将其分为彗星样细胞和非彗星样细胞，计数一定量细胞中彗星样细胞所占的比例，即彗星样细胞发生率
（comet％），估计 DNA 的损伤程度。通过镜下观察，计数 500 个细胞，直接得到，方便实用。
2）距离指标，即直接在显微镜下或在照片上测出彗星的一些长度数值。
（1）   尾长（Tail Length；µm）：沿电泳方向尾部最远端与头部中心间的距离（迁移距离）――距离越长，DNA 损伤越严重
（2）   总彗星长度（comet length；µm）：从头至尾，电泳方向上的最大长度――长度越大，DNA 损伤越严重
（3）   尾长与头部直径比值：沿电泳方向尾部最远端与头部中心间的距离与头部直径之比――比值越大，DNA 损伤越严重
3）强度指标，即 DNA 含量
（1）   头部和尾部荧光百分比：尾部总荧光强度与头部总荧光强度的比值――百分比越高，DNA 损伤越严重
（2）   尾部和总彗星荧光百分比（Tail DNA％）：检测 500 个细胞
等级    Tail DNA%    DNA 损伤程度
0    < 5        无损伤
1    5－20        轻度
2    20－40        中度
3    40－95        重度
4    > 95        完全

4）矩类指标，构建距离、强度的平均关系数值
（1）   尾矩（tail moment；TM），又称为 Olive tail moment（OTM）：尾部 DNA   占总 DNA 的百分比与头、尾部中心间距的乘积，单位为µm%或µm tail fraction
（2）   彗星矩（comet moment；CM）：以头部中心点为零点，沿电泳方向将彗星按一定的间隔分成若干个区域（ 80 个），分别测定每个区域的荧光强度乘以该区域中心距零点的距离除以彗星总荧光强度
7. 构建 DNA 损伤程度和药物处理剂量（dose）或时间（time）曲线

注意事项
1 ．本产品为 20 次操作
2 ．操作时须戴手套
3 ．整个操作，建议在暗光下进行
4 ．胶体液（Reagent A）和基质液（Reagent B）微波炉加热融化时，松开瓶盖，低功率，且密切观察，
防止过度加热，导致溢出或干枯
5 ．建议使用新鲜培养的细菌细胞
6 ．如果细菌的鞭毛功能较强，或细胞壁难以裂解，建议使用细菌细胞彗星实验预处理试剂盒-
G&VS10082.3
7 ．可以使用 100 微摩尔/升过氧化氢或 25 微摩尔/升高锰酸钾冰上孵育 10 分钟预处理样品作为阳性对照
8 ．操作时小心轻柔，避免胶体脱位
9 ．电泳温度过高，会造成胶体脱位
10 ．电泳时，根据用户所使用的电泳槽的电极两端实际距离，按照 1.5 伏/厘米确定电压强度
11．细菌 DNA 损伤彗星图像如下（400 倍）
12 ．由于细菌染色体只有 1 条，闭环 DNA 链，3000 左右 kb ，彗星尾巴形态常为线条状或弥散状
13 ．本公司提供系列 DNA 损伤检测分析试剂产品

质量标准
1 ．本产品经鉴定性能稳定
2 ．本产品经鉴定重复性好

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息

编号        名称                规格
G&VS10082.2    细菌 DNA 损伤彗星完全荧光检测试剂盒    20 次
G&VS10082.2A    胶体液（Reagent A）            毫升
G&VS10082.2B    基质液（Reagent B）            毫升
G&VS10082.2C    酶解液（Reagent C）            毫升
G&VS10082.2D    裂解液（Reagent D）        毫升
G&VS10082.2E    解构液（Reagent E）            毫升
G&VS10082.2F    电泳液（Reagent F）            毫升
G&VS10082.2G    中和液（Reagent G）        毫升
G&VS10082.2H    染色液（Reagent H）        毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                    规格
G&VS10074. 1    通用型 DNA 损伤彗星检测试剂盒            20 次
G&VS10074.2    通用型 DNA 损伤彗星检测完全试剂盒（荧光染色）    20 次
G&VS10074.3    通用型 DNA 损伤彗星检测完全试剂盒（银染）    20 次
G&VS10074.4    DNA 损伤彗星中性检测完全试剂盒（荧光染色）    20 次
G&VS10074.5    DNA 损伤彗星中性检测完全试剂盒（银染）        20 次
G&VS10075    过氧化氢处理 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10076    内切核酸酶 III 处理 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒    20 次
G&VS10077    FGP 处理 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10078    紫外线处理 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10079    细胞 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10080    组织 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10081    植物 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10082. 1    细菌 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10082.2    细菌 DNA 损伤彗星完全荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10082.3    细菌细胞彗星实验预处理试剂盒            20 次
G&VS10128    果蝇 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10129    精子细胞 DNA 损伤彗星荧光检测试剂盒        20 次
G&VS10130    荧光原位杂交彗星检测试剂盒            20 次