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细胞长链脂酰辅酶 A 合成酶活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2025/7/3 9:56:54 阅读次数：32

细胞长链脂酰辅酶 A 合成酶活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞长链脂酰辅酶 A 合成酶（LONG-CHAIN ACYL COA SYNTHETASE；LACS）活性酶连续循环光度法定量检测试剂是一种旨在通过肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的酶连续反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法来测定细胞裂解样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解悬液样品（动物、人体等）长链脂酰辅酶 A 合成酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
脂肪酸β氧化过程 (β-oxidation）在动物组织的线粒体发生的脂肪酸代谢通路，可概括为活化、转移、β氧化及最后经三羧酸循环被彻底氧化生成CO2和H2O ，并释放能量等四个阶段。脂酰辅酶A合成酶（acyl coA
synthetase；EC.6.2. 1.3），又称为脂肪酸硫激酶（fatty acid thiokinase）或脂酰辅酶A连接酶（acyl coA ligase），是脂肪酸进入β-氧化前的活化所必需：在ATP、CoA-SH 、Mg2+存在下，催化饱和或不饱和直链脂肪酸分子（C4）连接辅酶A合成相应的脂酰辅酶A。其为一高能化合物，水溶性增强，提高代谢活性。当脂肪酸进入细胞后，在内质网及线粒体外膜上先被活化，形成脂酰辅酶A衍生物，然后再进入线粒体内氧化。脂酰辅酶A合成酶分成三种底物特异性的种类：小于4个碳（C4）的短链脂酰辅酶A合成酶（acetyl-CoA synthetase），介于4至12个碳（C4－C12）的中链脂酰辅酶A合成酶（butyryl-CoA synthetase），和大于12个碳（C12）的长链脂酰辅酶A合成酶（palmitoyl CoA synthetase）。基于长链脂肪酸棕榈酸（palmitate）和辅酶A在长链脂酰辅酶A合成酶的作用下，产生棕榈酰辅酶A（palmitoyl-CoA）后，通过肌激酶（myokinase）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase）和乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase）系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized nicotinamide
adenine dinucleotide；NAD）的变化（340nm波长），来定量分析长链脂酰辅酶A合成酶的活性。长链脂酰辅酶A合成酶连续循环反应系统为：

Long-chain acyl coA synthetase
palmitate    +    CoA      +    ATP           →      palmitoyl-CoA    +    AMP    +    PPi

myokinase
AMP    +    ATP    → 2ADP

pyruvate kinase
2 ADP    +    2 phosphoenolpyruvate      →    2 ATP    +    2 pyruvate

lactic dehydrogenase
2 pyruvate    +    2 β-NADH        → 2 lactate    +    2 β- NAD+

产品内容
清理液（Reagent A）        120 毫升
裂解液（Reagent B）        10 毫升
缓冲液（Reagent C）        5 毫升
反应液（Reagent D）    500 微升
酶促液（Reagent E）        250 微升
底色液（Reagent F）        250 微升
阴性液（Reagent G）    250 微升
产品说明书        1 份

保存方式
保存反应液（Reagent D）、酶促液（Reagent E）和底色液（Reagent F）在－20℃冰箱里；其余的保存在 4℃ 冰箱里；反应液（Reagent D）和底色液（Reagent F）避免光照；有效保证 6 月

用户自备
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器 1.5 毫升离心管：用于样品保存的容器
细胞刮脱棒：用于脱离贴壁细胞
（微型）台式离心机：用于样品制备
200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板：用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤
一、样品准备
1 ．准备好 75cm2 细胞培养瓶或 100mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 107 细胞）
2 ．小心加入 3 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3 ．小心抽去清理液
4 ．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5 ．加入 3 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6 ．移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7 ．放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
8 ．小心抽去上清液
9 ．加入 500 微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10 ．转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11．强力涡旋震荡 15 秒
12 ．置于冰槽里孵育30 分钟
13 ．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415）
14 ．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
15 ．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
16 ．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1 ．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃)：波长 340nm ，间隔 5 分钟，读数 4 次（共 15 分钟），并置零
2 ．从－20℃冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液（Reagent D）和底色液（Reagent F）避免光照
3 ．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1 ．移取 195 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 25 微升反应液（Reagent D）
3 ．加入 12.5 微升酶促液（Reagent E）
4 ．加入 12.5 微升底色液（Reagent F）
5 ．上下倾倒数次，混匀
6 ．在 25℃温度下孵育 3 分钟
7 ．加入 5 微升阴性液（Reagent G）
8 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
9 ．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0 分钟读数－15 分钟读数）

四、样品测定
1 ．移取 195 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 25 微升反应液（Reagent D）
3 ．加入 12.5 微升酶促液（Reagent E）
4 ．加入 12.5 微升底色液（Reagent F）
5 ．上下倾倒数次，混匀
6 ．在 25℃温度下孵育 3 分钟
7 ．加入 5 微升待测样品（50 微克蛋白）（注意：样品须清澈）
8 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
9 ．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0 分钟读数－15 分钟读数）

五、计算样品活性
[（样品读数－背景读数）X 0.25（体系容量；毫升）X 样品稀释倍数]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22（毫摩尔吸光系数）X 15（反应时间；分钟）X 2] ＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔棕榈酰辅酶 A /分钟

六、酶标仪测定
1 ．在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2 ．分别移取 195 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里
3 ．分别加入 25 微升反应液（Reagent D）
4 ．分别加入 12.5 微升酶促液（Reagent E）
5 ．分别加入 12.5 微升底色液（Reagent F）
6 ．轻轻摇动 96 孔板
7 ．在 25℃温度下孵育 3 分钟
8 ．分别加入 5 微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50 微克蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
9 ．轻轻摇动 96 孔板
10 ．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 15 分钟读数
11．活性计算：
[（样品读数－背景读数）X 样品稀释倍数 X 0.25（体系容量；毫升）]÷[0.005（样品容量；毫升）X 6.22   （毫摩尔吸光系数）X 0.6（光径距离；厘米）X 15（反应时间；分钟）X 2] ＝单位/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝单位/毫克
单位＝微摩尔棕榈酰辅酶 A/分钟

注意事项
1 ．本产品为 20 次操作，包括背景对照
2 ．操作时，须戴手套
3 ．系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ．建议使用比色皿测定
5 ．样品须澄清，至关重要
6 ．加样后3 秒内光度测定
7 ．测定值由高到低变化；测定可持续 15 分钟
8 ．光度测定后，比色皿须清洗彻底
9 ．样本测定 0 分钟读数高于 15 分钟读数表明具有酶活性
10 ．建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/5 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒- GMS30030. 1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12 ．长链脂酰辅酶 A 合成酶单位活性定义为：在 25℃ , pH 8. 1 条件下，每分钟内能够合成 1 微摩尔棕榈酰辅酶 A 所需的酶量作为一个活性单位
13 ．本公司提供系列脂肪酸代谢检测试剂产品

质量标准
1 ．本产品经鉴定性能稳定
2 ．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                        规格
GMS50117. 1.3    细胞长链脂酰辅酶 A 合成酶活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117. 1.3A    清理液（Reagent A）                    500 毫升
GMS50117. 1.3B    裂解液（Reagent B）                    100 毫升
GMS50117. 1.3C    缓冲液（Reagent C）                    100 毫升
GMS50117. 1.3D    反应液（Reagent D）                10 毫升
GMS50117. 1.3E    酶促液（Reagent E）                    10 毫升
GMS50117. 1.3F    底色液（Reagent F）                    10 毫升
GMS50117. 1.3G    阴性液（Reagent G）                1 毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                        规格
GMS50117. 1. 1细胞短链脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒 20 次
GMS50117. 1.2    细胞中链脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117. 1.3    细胞长链脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117. 1.4    细胞脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）总活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117.2. 1    组织短链脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117.2.2    组织中链脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117.2.3    组织长链脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
GMS50117.2.4    组织脂酰辅酶 A 合成酶（ACYL COA SYNTHETASE）总活性酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次