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细胞丙酮酸激酶总活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2025/7/3 11:24:54 阅读次数：17

细胞丙酮酸激酶总活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞丙酮酸激酶总活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶的酶偶联反应系统中还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）氧化后峰值的降低，即采用光度法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取悬液样品（动物、人体、昆虫等）丙酮酸激酶的总活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
丙酮酸激酶（Pyruvate Kinase；PK）是细胞代谢的调节酶，催化细胞糖酵解的最后反应：将磷酸烯醇丙酮酸（phosphoenol pyruvate；PEP）转化成丙酮酸（pyruvate），同时产生ATP 。丙酮酸激酶由4个相同的亚单位构成，在肝组织、肌肉组织和红细胞中有不同类型的异构体。果糖-2,6-二磷酸（Fructose-2,6-bisphosphate； F2,6BP）是该酶的激活剂，而ATP、蛋氨酸（alanine）、乙酰辅酶A （Acetyl-CoA）是该酶的抑制剂。丙酮酸激酶的活性检测用来评价细胞或组织，包括红细胞的损害状况。基于磷酸烯醇丙酮酸转化成丙酮酸后，通过乳酸脱氢酶系统，测定还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）的峰值变化（340nm 波长），来定量分析丙酮酸激酶的活性。丙酮酸激酶反应系统为：

产品内容
清理液（Reagent A）          XX 毫升
裂解液（Reagent B）          XX 毫升
缓冲液（Reagent C）          XX 毫升
反应液（Reagent D）          XX 毫升
底物液（Reagent E）          XX 毫升
阴性液（Reagent F）          XX 微升
产品说明书                              1 份

保存方式
保存反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）在－20℃冰箱里，避免光照；其余的保存在 4℃冰箱里，有效保证 6 月

用户自备
1.5 毫升离心管：用于样品制备和保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品制备的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于样品操作
比色皿或 96 孔板：用于光度分析的容器
分光光度仪或酶标仪：用于光度分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的反应液（Reagent D）和底物液（Reagent E）置入冰槽里融化。然后进行下列操作。

一、样品准备
1 ．准备好 25cm2 细胞培养瓶或 60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 106 细胞）
2 ．小心加入 XX 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3 ．小心抽去清理液
4 ．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：可以使用胰酶消化）
5 ．加入 XX 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6 ．移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7 ．放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
8 ．小心抽去上清液
9 ．加入 XX 微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10 ．转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11．强力涡旋震荡 15 秒
12 ．置于冰槽里孵育 30 分钟
13 ．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415） 14 ．小心移取 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
15 ．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1） 16 ．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1 ．准备好待测样品（例如细胞裂解萃取悬液样品等），置于冰槽里
2 ．设定好分光光度仪（温度为 30℃)：波长 340nm ，间隔 60 秒，读数 6 次（共 5 分钟），并置零 3 ．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1 ．移取 XX 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 XX 微升反应液（Reagent D）
3 ．加入 XX 微升底物液（Reagent E）
4 ．上下倾倒数次，混匀
5 ．在 30℃温度下孵育 3 分钟
6 ．加入 XX 微升阴性液（Reagent F）
7 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照（0 分钟读数－5 分钟读数），正常读数差值为 0.001 至 0.005

四、样品测定
1 ．移取 XX 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 XX 微升反应液（Reagent D）
3 ．加入 XX 微升底物液（Reagent E）
4 ．上下倾倒数次，混匀
5 ．在 30℃温度下孵育 3 分钟
6 ．加入 20 微升待测样品（50 微克细胞裂解总蛋白）（注意：样品须清澈，且pH 为7.5） 7 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ．即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数（0 分钟读数－5 分钟读数），通常活性读数差值为正数

五、计算样品活性

单位＝微摩尔 PEP/分钟

六、酶标仪测定
1 ．在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2 ．分别移取 XX 微升缓冲液（Reagent C）到相应孔里
3 ．分别加入 XX 微升反应液（Reagent D）
4 ．分别加入 XX 微升底物液（Reagent E）
5 ．轻轻摇动 96 孔板
6 ．在 30℃温度下孵育 3 分钟
7 ．分别加入 XX 微升阴性液（Reagent F）或待测样品（50 微克细胞裂解总蛋白）（注意：样品须清澈，且pH 为7.5）
8 ．轻轻摇动 96 孔板
9 ．即刻放进酶标仪检测，包括（0 分钟初始读数和 5 分钟读数）
10 ．活性计算

单位＝微摩尔 PEP/分钟

注意事项
1 ．本产品为 20 次（比色皿）和 80 次（96 孔板）操作，包括背景对照
2 ．操作时，须戴手套
3 ．系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ．样品须澄清，至关重要
5 ．建议使用比色皿测定
6 ．加样后 3 秒内光度测定
7 ．测定值由高到低变化；测定可持续 5 分钟
8 ．光度测定后，比色皿须清洗彻底
9 ．背景空对照 0 分钟读数通常 0.2 至 0.8 为理想状态
10 ．背景空对照的正常读数差值（0 分钟－5 分钟）通常为 0.001 至 0.005（正负即可）
11．样本测定 5 分钟读数低于 0 分钟读数表明具有酶活性
12 ．建议待测样本蛋白浓度为 50 微克/20 微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒 G&VS30030. 1）
13 ．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
14 ．丙酮酸激酶单位活性定义为：在 30℃ , pH 7.2 条件下，每分钟内能够转化 1 微摩尔磷酸烯醇丙酮酸至丙酮酸所需的酶量作为一个活性单位
15 ．本公司提供系列细胞酶学检测试剂产品

质量标准
1 ．本产品经鉴定性能稳定
2 ．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺” 的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                    规格
G&VS50094. 1    细胞丙酮酸激酶总活性光度法定量检测试剂盒     20/80 次
G&VS50094. 1A    清理液（Reagent A）                500 毫升
G&VS50094. 1B    裂解液（Reagent B）                100 毫升
G&VS50094. 1C    缓冲液（Reagent C）                100 毫升
G&VS50094. 1D    反应液（Reagent D）            10 毫升
G&VS50094. 1E    底物液（Reagent E）                10 毫升
G&VS50094. 1F    阴性液（Reagent F）                1 毫升
G&VS30030. 1    Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒            200 次

试剂盒订购信息
产品编号        名称                        规格
G&VS50094.1    细胞丙酮酸激酶（PK）总活性光度法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50094.2    组织丙酮酸激酶（PK）总活性光度法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50094.3    细菌丙酮酸激酶（PK）总活性光度法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50112. 1    细胞己糖激酶（HEXOKINASE）酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50112.2    组织己糖激酶（HEXOKINASE）酶连续循环光度法定量检测试剂盒    20 次