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细胞 c-Kit 激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2025/7/3 11:33:20 阅读次数：24

细胞 c-Kit 激酶活性光度法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
细胞 c-Kit激酶活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在 c-Kit激酶敏感性抑制剂存在与否的情况下，受到 c-Kit 磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生 ADP 过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光度法测定其氧化后吸光峰值的变化，以分析细胞裂解样品中 c-Kit 活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中 c-Kit 激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景
肥大细胞/干细胞生长因子受体（Mast/stem cell growth factor receptor；SCFR；EC2.7.10. 1），又称为v-kit
Hardy-Zuckerman4猫科肉瘤病毒致癌基因同源物（V-kit Hardy-Zuckerman 4 feline sarcoma viral oncogene
homolog；c-kit）或CD117抗原，是一种原癌基因（protooncogene）编码蛋白，属于受体型酪氨酸蛋白激酶（receptor tyrosine kinase；RTK）家族成员，为III型跨膜受体，145kD分子量，含有5个免疫球蛋白类环状细胞外结构域（extracellular domain with 5 Ig-like loops）、高度疏水性跨膜结构域和细胞内活性结构域（包括ATP结合区和磷酸基团转移酶区）。作为细胞表面细胞因子受体，与干细胞生长因子结合，引发一系列信号通路反应，激活下游PLC γ 、p85/PI3K、SHP2 、CrKl等酶活。其功能在于控制造血干细胞、肥大细胞、黑色素细胞、生殖细胞的生成、生长和激活，调节细胞转化、分化、繁殖、存活、粘附和趋化作用。一旦发生突变，则产生胃肠道间质肿瘤（stromal tumor）、肥大细胞增多症（mastocytosis）、急性粒细胞性白血病（acute myelogenous leukemia）、斑驳病（Piebaldism）、精原细胞瘤（seminoma）、小细胞型肺癌、卵巢肿瘤、黑色素瘤等。活性过高则引起炎性状况。C-Kit已经成为肿瘤治疗的药物靶标。基于底物
GGLFDDPSYVNVQNL ，在c-Kit激酶敏感性抑制剂马赛替尼（Masitinib；AB1010）存在与否的情况下，受到c-Kit激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析血管内皮细胞生长因子受体2的活性。其反应方式为：

产品内容
清理液（Reagent A）        毫升
裂解液（Reagent B）        毫升
缓冲液（Reagent C）        毫升
酶促液（Reagent D）    毫升
反应液（Reagent E）        毫升
底物液（Reagent F）        毫升
阴性液（Reagent G）    微升
专性液（Reagent H）    微升
产品说明书        1 份

保存方式
保存清理液（Reagent A）在 4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证 6 月

用户自备
c-Kit 激酶：用于抑制剂筛选
1.5 毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
15 毫升锥形离心管：用于样品处理的容器细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
200 微升 1 厘米光径比色皿或 96 孔板：用于光度分析操作的容器分光光度仪或酶标仪：用于样品光度分析

实验步骤
一、待测样品准备
1 ．准备好 75cm2 细胞培养瓶或 100mm 细胞培养皿的待测培养细胞（1 至 5 X 107 细胞）
2 ．小心加入 xx 毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3 ．小心抽去清理液
4 ．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5 ．加入 xx 毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6 ．移入到预冷的 15 毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7 ．放进 4℃台式离心机离心 5 分钟，速度为 300g
8 ．小心抽去上清液
9 ．加入 xx 至 xx 微升裂解液（Reagent B），充分混匀（注意：可以调节蛋白浓度）
10 ．转移到预冷的 1.5 毫升离心管
11．强力涡旋震荡 15 秒
12 ．置于冰槽里孵育30 分钟
13 ．放进 4℃微型台式离心机离心 5 分钟，速度为 16000g（或 13000RPM ，例如 eppendorf 5415）
14 ．小心移取 100 至 500 微升上清液到新的预冷的 1.5 毫升离心管
15 ．移取 10 微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
16 ．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1 ．准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2 ．设定好分光光度仪（温度为 30℃)：波长为 340nm ，间隔 1 分钟，读数 6 次（共 5 分钟），并置零
3 ．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1 ．移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ．加入 xx 微升反应液（Reagent E）
4 ．加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5 ．放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
6 ．加入 xx 微升阴性液（Reagent G）
7 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340 波长读数 0 分钟－340 波长读数 5 分钟

四、样品总活性测定
1 ．移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ．加入 xx 微升反应液（Reagent E）
4 ．加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5 ．放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
6 ．加入 10 微升待测样品（注意：100 微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340 波长读数 0 分钟－340 波长读数 5 分钟

五、样品非特异活性测定
检测开始前，移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 1.5 毫升离心管，分别加入 xx 微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：100 微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进 30℃培养箱里孵育30 分钟。然后继续下列操作。
1 ．移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2 ．加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
3 ．加入 xx 微升反应液（Reagent E）
4 ．加入 xx 微升底物液（Reagent F）
5 ．放进 30℃培养箱里静置 3 分钟
6 ．加入 40 微升上述预处理的待测样品
7 ．上下倾倒数次，混匀（限定在 3 秒之内）
8 ．即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数：340 波长读数 0 分钟－340 波长读数 5 分钟

六、计算样品活性
1）样品总活性和非特异活性计算
2）样品特异活性计算

六、酶标仪测定
1）样品总活性测定
1 ．在 96 孔板上做好相应标记：背景对照和样品
2 ．分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里
3 ．分别加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
4 ．分别加入 xx 微升反应液（Reagent E）
5 ．分别加入 xx 微升底物液（Reagent F）
6 ．轻轻摇动 96 孔板
7 ．在 30℃温度下孵育 3 分钟
8 ．分别加入 xx 微升阴性液（Reagent G）或待测样品（100 微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔里（注意：样品须清澈）
9 ．轻轻摇动 96 孔板
10 ．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数
11．活性计算：

2）样品非特异活性测定
检测开始前，移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 1.5 毫升离心管，分别加入 xx 微升专性液（Reagent H）和待测样品（注意：100 微克细胞裂解蛋白），混匀后，放进 30℃培养箱里孵育30 分钟。然后继续下列操作。
1 ．在 96 孔板上做好相应标记：待测样品
2 ．移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到 96 孔板里
3 ．加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
4 ．加入 xx 微升反应液（Reagent E）
5 ．加入 xx 微升底物液（Reagent F）
6 ．轻轻摇动 96 孔板
7 ．在 30℃温度下孵育 3 分钟
8 ．加入 40 微升上述预处理的待测样品
9 ．轻轻摇动 96 孔板
10 ．即刻放进酶标仪检测：0 分钟读数和 5 分钟读数
11．活性计算：
单位＝微摩尔 NADH/分钟
3）样品特异活性计算
特异活性＝总活性－非特异活性

七、抑制剂筛选
1 ．在 96 孔板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2 ．按下表加入试剂，进行样品预处理

内容物        空背景对照    样本背景        完全酶活性    待测抑制剂酶活性

缓冲液（Reagent C）    xx 微升        xx 微升        xx 微升        xx 微升
阴性液（Reagent G）xx 微升        x 微升        xx 微升        ——
待测抑制剂    ——        xx 微升        ――        xx 微升
用户自备的纯化酶    ——        ——        xx 微升（1 毫单位）    xx 微升（1 毫单位）
96 孔板每孔总量   空背景对照孔（40 微升）   样本背景孔（40 微升）   完全活性孔（40 微升）   待测抑制剂样品孔
（40 微升）
轻轻摇动96 孔板，混匀，放进 30℃培养箱里孵育30 分钟。然后进行下列操作

3 ．分别移取 xx 微升缓冲液（Reagent C）到新的 96 孔板的所有孔里
4 ．分别加入 xx 微升酶促液（Reagent D）
5 ．分别加入 xx 微升反应液（Reagent E）
6 ．分别加入 xx 微升底物液（Reagent F）
7 ．轻轻摇动 96 孔板
8 ．在 30℃温度下孵育 3 分钟
9 ．加入 40 微升上述预处理的待测样品
10 ．即刻放进 30℃酶标仪检测：测读 30 分钟
11．抑制活性计算：
1)      [（完全活性读数－空背景对照读数）－（抑制剂样品活性读数－样本背景读数）]÷（完全活性读数－空背景对照读数）＝实际抑制百分率
2)      IC50：50％抑制率所需的抑制剂浓度
X（所需抑制剂样品浓度）＝（已知抑制剂样品浓度÷实际抑制百分率）X 50%
3)      直接构建抑制曲线：纵座标（Y 轴）为吸光单位（OD）；横座标（X 轴）为已知抑制剂浓度

注意事项
1 ．本产品为 20 次操作
2 ．操作时，须戴手套
3 ．系统操作过程中，背景测定只需 1 次
4 ．样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5 ．样品须澄清，至关重要
6 ．加入样品启动反应后3 秒内即刻光度测定
7 ．建议使用比色皿测定
8 ．测定值由高到低变化；测定可持续 30 分钟
9 ．光度测定后，比色皿须清洗彻底
10 ．样本测定 0 分钟读数高于 5 分钟读数表明具有酶活性
11．样本测定读数持续上升，表明酶活过低或样品量过低
12 ．非特异活性高于总活性，表明特异性酶活过低或样品量过低
13 ．建议待测样本蛋白浓度为 100 微克/10 微升（本公司提供 Bradford 蛋白质浓度定量试剂盒- G&VS30030. 1）
14 ．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
15 ．可以使用 c-Kit 抑制剂 ISCK03（IC50=5 微摩尔）作为抑制剂对照或阴性对照
16 ．c-Kit 活性单位浓度定义：在 30℃温度下，pH 7.5 条件下，每分钟内能够氧化 1 微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
17 ．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准
1 ．本产品经鉴定性能稳定
2 ．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后 10 天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK ， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                规格
G&VS50197. 1.3    细胞 c-Kit激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50197. 1.3A    清理液（Reagent A）            毫升
G&VS50197. 1.3B    裂解液（Reagent B）            毫升
G&VS50197. 1.3C    缓冲液（Reagent C）            毫升
G&VS50197. 1.3D    酶促液（Reagent D）        毫升
G&VS50197. 1.3E    反应液（Reagent E）            毫升
G&VS50197. 1.3F    底物液（Reagent F）            毫升
G&VS50197. 1.3G    阴性液（Reagent G）        毫升
G&VS50197. 1.3H    专性液（Reagent H）        毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                    规格
G&VS50197.1    细胞 C-KIT 激酶活性光度法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50197.2    组织 C-KIT 激酶活性光度法定量检测试剂盒        20 次
G&VS50229.1    细胞 VEGFR1（FLT-1）激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50229.2    组织 VEGFR1（FLT-1）激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50229.3    细胞 VEGFR2 激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50229.4    组织 VEGFR2 激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50773. 1    细胞 VEGFR3 激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50773.2    组织 VEGFR3 激酶活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50774. 1    细胞 VEGFR 激酶总活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50774.2    组织 VEGFR 激酶总活性光度法定量检测试剂盒    20 次
G&VS50219.1    细胞 PDGFRα激酶活性定量检测试剂盒（A/B/C）    20 次
G&VS50219.2    组织 PDGFRα激酶活性定量检测试剂盒（A/B/C）    20 次
G&VS50219.3    细胞 PDGFRβ激酶活性定量检测试剂盒（A/B/C）    20 次
G&VS50219.4    组织 PDGFRβ激酶活性定量检测试剂盒（A/B/C）    20 次