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细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法定量检测试剂盒

发布时间：2025/7/9 15:43:25 阅读次数：27

细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法定量检测试剂盒

主要用途
细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法定量检测试剂是一种旨在通过通用底物H3多肽，在敏感性抑制剂存在与否的情况下，通过GCN5-HAT的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上的过程中，释放出巯基辅酶A，进而与Ellman试剂反应，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物吸光峰值的变化，即采用光度法来测定细胞裂解萃取样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、核蛋白样品、部分或完全纯化酶样品中GCN5-HAT的特异活性检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景
核小体（nucleosome）是染色质的最小结构单位，由组蛋白H2A-H2B双体和H3-H4双体构成的组蛋白八体结构（octamer），外层涵盖146碱基DNA。其结构中组蛋白N末端为游离状态，且高度进化保留，在特定氨基酸部位发生诸如甲基化、乙酰化、磷酸化修饰，以改变其电荷和功能。组蛋白上特定赖氨酸残基的ε氨基基团的乙酰化通过组蛋白乙酰转移酶（Histone Acetyltransferase；HAT；EC2.3.1.48）催化产生，具有表观遗传学的调节作用，达到染色体重构（remodeling），染色质松弛打开，促使基因转录。其功能异常将导致肿瘤、神经退行性疾病、AIDS和炎症。组蛋白乙酰转移酶，又称为赖氨酸乙酰转移酶（lysine acetyltransferase）；KAT），分成二型，细胞核内的A型，包括P300/CBP、Gcn5、TAFII250等，和细胞浆内的B型，例如Hat1。其又分成六类：P300/CBP（P300/cAMP Responsive Element-Binding Protein），包括P300、CBP等；GNAT（Gcn5-related N-acetyltransferase），包括Gcn5、PCAF、Hat1、Elp3、Hpa2、Hpa3、ATF-2、Nut1等；MYST（MOZ、ybf2/sas3、sas2、Tip60），还包括Esa1、MOF、MORF、HBO1等；核受体共激活因子（nuclear receptor co-activator），包括SRC-1、SRC-3、ACTR、TIF2；TAFII250（TATA box binding protein associated factor）；TFIIIC（transcriptional factor IIIC）等。其中GCN5（氨基酸合成总控制蛋白5；general control of amino acid synthesis protein 5），又称为KAT2A（赖氨酸乙酰转移酶2A；lysine acetyltransferase 2A），进化高度保留，为转录共激活因子，调节染色体结构，促进GCN5依赖性的最大转录水平和基因表达，包括能量代谢、应激反应、细胞毒性和死亡。催化转移乙酰辅酶A上的乙酰基团到组蛋白H3或非组蛋白（例如CEBPB）的赖氨酸残基上。酵母GCN5有2个关联复合体：SAGA和Ada，均乙酰化核小体组蛋白H3和H2B。真菌GCN5主要调节植物真菌病原性中自噬的向光性或饥饿性诱导和无性孢子形成，与真菌毒力相关。GCN5异常，会导致早期胚胎死亡、肿瘤和糖尿病等。基于底物H3组蛋白多肽Ac-Gln-Thr-Ala-Arg-Lys-Ser-Thr-Gly-Gly-Lys- Ala- Pro-Arg-Lys-Gln-Leu-Ala-Thr- Lys-NH2 （H3组蛋白N末端5至23氨基酸残基），在GCN5敏感性抑制剂MB3存在与否的情况下，通过GCN5的作用，将乙酰辅酶A上的乙酰基团，转移到多肽分子上，由此产生乙酰化多肽和巯基辅酶A（CoA-SH），与Ellman试剂5，5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5，5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量测定GCN5组蛋白乙酰转移酶的特异活性。其反应系统为：


产品内容
裂解液（Reagent A）     毫升
分离液（Reagent B）     毫升
清理液（Reagent C）     毫升
萃取液（Reagent D）     毫升
缓冲液（Reagent E）        毫升
反应液（Reagent F）        微升
底物液（Reagent G）    毫升
显色液（Reagent H）    毫升
专性液（Reagent I）        微升
产品说明书        1份

保存方式
保存反应液（Reagent F）、底物液（Reagent G）、显色液（Reagent H）和专性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；显色液（Reagent H）避免光照，有效保证6月

用户自备
磷酸盐缓冲溶液（PBS）：用于清洗细胞样品
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
1.5毫升离心管：用于样品操作和保存的容器
细胞刮脱棒：用于细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
96孔板或200微升1厘米光径比色皿：用于反应和光度分析的容器
酶标仪或分光光度仪：用于光度分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂置入冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1．准备好75cm2细胞培养瓶或100mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 107细胞）
2．小心抽去培养液
3．小心加入10毫升用户自备的磷酸盐缓冲溶液（PBS），覆盖生长表面
4．小心抽去清理液
5．使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
6．加入xx毫升裂解液（Reagent A），混匀细胞
7．移入到预冷的15毫升锥形离心管
8．强力涡旋震荡10秒
9．置于冰槽里孵育15分钟
10．加入xx毫升预冷的分离液（Reagent B），混匀
11．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
12．小心抽去上清液
13．加入xx毫升预冷的清理液（Reagent C）
14．放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为1300g
15．小心抽去上清液
16．小心加入xx微升预冷的萃取液（Reagent D），混匀
17．转移到新的预冷的1.5毫升离心管
18．超声处理30秒：功率100瓦，10秒一次，间隔2分钟，重复2次（注意：保持在冰槽里）
19．置于冰槽里孵育30分钟
20．放进4℃微型台式离心机离心10分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如EPPENDORF 5415）
21．小心移取上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
22．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－GMS30030.1）
23．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1．准备好待测样品（例如核蛋白或纯化酶样品等），置于冰槽里
2．开启并设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长412nm，间隔5分钟，读数3次（共15分钟），并置零
3．缓冲液（Reagent E）室温下均衡温度

三、样品总活性测定
1．标记好样本背景和样本活性管（孔）
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿或96孔板
3．加入xx微升缓冲液（Reagent E）到样本背景管（孔）
4．加入xx微升反应液（Reagent F）到样本活性管（孔）
5．分别加入xx微升底物液（Reagent G）到所有管（孔）
6．加入xx微升显色液（Reagent H）
7．分别加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）到所有管（孔）
8．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
9．即刻放进分光光度仪检测，获得样品背景和样品总活性读数（15分钟读数－0分钟读数）

四、样品非特异活性测定
1．标记好样本非特异活性管（孔）
2．移取xx微升缓冲液（Reagent E）到新的比色皿或96孔板
3．加入xx微升反应液（Reagent F）
4．加入xx微升底物液（Reagent G）
5．加入xx微升专性液（Reagent I）
6．加入xx微升显色液（Reagent H）
7．加入10微升待测样品（注意：50微克核蛋白；样品须清澈）
8．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
9．即刻放进分光光度仪检测，此为样品非特异活性读数（15分钟读数－0分钟读数）

五、计算样品实际活性
1）总活性和非特异活性
2）样品特异活性

注意事项
1．本产品为20次操作，包括平行背景对照
2．操作时，须戴手套
3．样品须澄清，至关重要
4．样品处理时，避免使用巯基乙醇、DTT等
5．加样后3秒内光度测定
6．测定值由低到高变化
7．测定值吸光读数越高，表明酶活性越高
8．光度测定后，比色皿须清洗彻底
9．待测样本为核蛋白样品，其蛋白浓度为50微克/10微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒GMS30030.1）
10．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
11．GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）单位活性定义为：在25℃，pH 7.5条件下，每分钟内能够释放1纳摩尔巯基辅酶A所需的酶量作为一个活性单位
12．本公司提供系列组蛋白乙酰转移酶检测试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组份订购信息
编号            名称                    规格
GMS50803.1    细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶活性光度法定量检测试剂盒        20次
GMS50803.1A    裂解液（Reagent A）                    毫升
GMS50803.1B     分离液（Reagent B）                    毫升
GMS50803.1C    清理液（Reagent C）                    毫升
GMS50803.1D     萃取液（Reagent D）                毫升
GMS50803.1E     缓冲液（Reagent E）                    毫升
GMS50803.1F     反应液（Reagent F）                    毫升
GMS50803.1G     底物液（Reagent G）                毫升
GMS50803.1H     显色液（Reagent H）                毫升
GMS50803.1I     专性液（Reagent I）                    毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                                规格
GMS50802.1    细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性荧光定量检测试剂盒        20次
GMS50802.2    组织GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性荧光定量检测试剂盒        20次
GMS50803.1    细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法定量检测试剂盒        20次
GMS50803.2    组织GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法定量检测试剂盒        20次
GMS50804.1    细胞GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法（340nm）定量检测试剂盒    20次
GMS50804.2    组织GCN5组蛋白乙酰转移酶（GCN5-HAT）活性光度法（340nm）定量检测试剂盒    20次