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发布时间：2025/7/10 11:23:00 阅读次数：2
黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒使用说明书
【产品简介】
黄曲霉毒素是一类真菌（如黄曲霉和寄生曲霉）的有毒的代谢产物，它们具有很强的致癌性，主要存在于谷物、坚果、棉籽以及一些和人类血液，动物饲料相关的产品中。其中黄曲霉毒素B1的毒性、致癌性、污染频率均居于首位。薄层色谱一直是检测黄曲霉毒素常用的方法，但是此方法制备样品及分析样品时费时又费力。而使用黄曲霉毒素B1 ELISA试剂盒则能够快速而准确的分析样品中黄曲霉毒素B1残留。参考国家标准GB/T 5009.22-2003。
【测定原理】
本试剂盒采用间接竞争ELISA方法，在微孔条上预包被偶联抗原，样本中的残留物黄曲霉毒素B1和微孔条上预包被的偶联抗原竞争黄曲霉毒素B1抗体，加入酶标记物后，用TMB底物显色，样本吸光值与其所含残留物黄曲霉毒素B1的含量成负相关，与标准曲线比较可得出相应残留物黄曲霉毒素B1的含量。
【试剂盒技术指标】
规 格：96孔/盒
灵 敏 度： 0.025ppb
检测时间： 75min
样本检测下限：
大米、玉米、小米………………………………2.5ppb
酱油、醋…………………………………………0.5ppb
食用油……………………………………………2.5ppb
酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒）…………………0.5ppb
花 生……………………………………………2.5ppb
月饼、桃酥、花生酱等……………………………1ppb
面 粉………………………………………………1ppb
一般饲料…………………………………………2.5ppb
饲料（配合料及浓缩料）…………………………1ppb
牛奶………………………………………………0.5ppb
反应率：
黄曲霉毒素B1……………………………………100%
回收率：
食 品…………………………………………85±10%
饲 料…………………………………………75±10%
【试剂盒组成】
1、微量测试孔：每条8孔，一板12条
2、标准溶液X6瓶：（1ml/瓶）0ppb、0.025ppb、0.075ppb、0.225ppb、0.675ppb、2.025ppb
3、酶标记物 12ml…………………………红色帽
4、抗体工作液 7ml…………………………绿色帽
5、底物液 A液 7ml…………………………棕色帽
6、底物液 B液 7ml…………………………黑色帽
7、终 止 液 7ml…………………………黄色帽
8、20X浓缩洗涤液40ml……………………白色帽
9、2X浓缩复溶液 50 ml…………………… 蓝色帽
【所用仪器、试剂】
仪 器：微孔板酶标仪450nm/630nm、旋转蒸发仪/
氮气吹干装置、均质器、振荡器、离心机、
刻度移液管、天平（感量0.01g ）
微量移液器：单道 20µl～200µl、100µl～1000µl、多道 250µl
试 剂：甲醇、三氯甲烷、正己烷、滤纸
【实验前溶液配制】
配液1、50%甲醇溶液：
50ml蒸馏水或去离子水和50ml纯甲醇混合制备50％甲醇溶液。
配液2、将2×浓缩复溶液用去离子水按照1：1稀释（1份浓缩复溶液+1份去离子水）用于样品的稀释。
配液3、将40ml浓缩洗涤液（20倍浓缩）用去离子水按照1：19稀释（1份浓缩洗涤液+19份去离子水），或按所需用量配制洗涤液。
【样本前处理步骤】
处理任何样本时，都必须注意：
（1）实验中须使用一次性吸头，在吸取不同的试剂时要更换吸头
（2）实验之前须检查实验器具是否干净，必要时可对实验器具进行清洁，以避免污染干扰实验结果。
一、食品
（a）脂肪含量小的固体样品(如大米、玉米、小米等)
1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min。
2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。
3、取出上清液50ul与稀释后的复溶液450ul 充分混合30s
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:100
(b)酱油、醋
1、称取2g样品于50ml离心管中；先加入3ml去离子水充分混匀，再加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；
2、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。
3、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。
4、取50ul与稀释后的复溶液950ul 充分混合30s，
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:20
(c)食用油(如菜油、麻油、色拉油、花生油等)
1、称取1g油样品于10ml离心管中，先加入2ml 正己烷，再加入5ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。
2、取下层溶液50ul与稀释后的复溶液200ul 充分混合30s
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:25
(d)酒类（葡萄酒、啤酒、黄酒）
1、称取2g酒样品于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min；
2、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。
3、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。
4、取50ul与稀释后的复溶液950ul 充分混合30s，
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:20
(b)花生
1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。
2、取下层溶液50ul与稀释后的复溶液450ul 充分混合30s
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:100
(e)月饼、桃酥、花生酱等
1、称取2g粉碎的样品于50ml离心管中，先加入5ml 正己烷，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。
2、取下层5mL提取液于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。
3、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。
4、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。
5、取50ul与稀释后的复溶液950ul 充分混合30s，
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:40倍
(f)面粉
1、称取2g面粉样品于50ml离心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；
2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。
3、取过滤溶液5mL于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。
4、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。
5、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。
6、取50ul与稀释后的复溶液950ul 充分混合30s，
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:40倍
二、饲料
(a)一般饲料及原料（脂肪和蛋白含量小的饲料)
1、称取1g粉碎的样品于50ml离心管中，加入10ml 的50%甲醇溶液混合；强力振荡5分钟。
2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。
3、取出上清液50ul与稀释后的复溶液450ul 充分混合30s
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:100
(b)配合料及浓缩料（脂肪和蛋白含量高的饲料)
1、称取2g样品于50ml离心管中，再加入10ml的50%甲醇溶液混合；强力振荡5min；
2、用Whatman No.1滤纸过滤；收集过滤液。
3、取过滤溶液5mL于50ml离心管中；加入10ml三氯甲烷，振荡5min，室温4000r/min以上，离心10min。
4、取出下层5ml的三氯甲烷到另一洁净容器中于50℃水浴中氮气/空气吹干。
5、加入1mL的50%甲醇溶液将充分溶解干燥物。
6、取50ul与稀释后的复溶液950ul 充分混合30s，
取50ul进行分析。
样本稀释倍数:40倍
三、乳制品
(a)生鲜牛奶；
1、直接取50µl牛奶+950µl稀释后的复溶液混合30s；
2、取50µl用于检测检测分析。
样本稀释倍数:20
(b)奶粉、奶油、奶酪
1、称取5g样品于50ml离心管中，加入10ml甲醇，强力振荡5min；室温4000r/min以上，离心10min。
2、取2ml上清液，于50℃水浴中氮气/空气吹干。
3、用1ml正己烷溶解残留物，加入1ml稀释后的复溶液混合30s；室温4000r/min以上，离心5min，
4、取50ul下层溶液进行检测分析。
样本稀释倍数:1
【备注】
如根据样品的国家允许量标准判定（详见附件表），在样品测定前，用稀释后的复溶液将样品提取液再进一步进行适当倍数稀释，即为待测样品液； 取50ul待测样品液进行定量或限量测定。
【酶标免疫分析程序】
操作步骤：
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置室温（20-25℃）平衡30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。
2、按板架及需要取出微孔条，将不用的微孔放入自封袋，保存于2-8℃。
3、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号每个样本和标准品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
4、加标准品/样本50µl/孔到各自的微孔中，然后加抗体50µl/孔，用盖板膜封板，轻轻震荡混匀。25℃环境中反应30min。
5、取出将孔内液体甩干，用洗液250µl/孔洗板4-5次，每次间隔15-30秒，用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
6、每孔加入酶标记物100µl，盖板膜盖板后置25℃环境中反应30min。将孔内液体甩干，用洗涤液充分洗，4-5遍（同上），用吸水纸拍干（拍干后未被清除的气泡可用干净的枪头刺破）。
7、 显色：每孔加入A液50µl，再加B液50µl，轻轻振荡混匀，25℃环境中避光显色15min。
8、测定：每孔加入终止液50µl，轻轻振荡，设定酶标仪于450nm处（建议用双波长450/630nm检测,在5min内读完数据）测定吸光度值（OD值）。
【结果判定】
结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样本吸光值与黄曲霉毒素B1的含量成负相关
1、粗略判定：
用样品的平均吸光度值与标准值比较即可得出样本所含M1浓度范围（ng/ml）。假设样品1的吸光度值为0.248，样品2的吸光度值为1.021，标准液吸光度值分别是：0ppb为1.821；0.025ppb为1.434；0.075ppb为1.163； 0.225ppb为0.767； 0.675ppb为0.298； 2.025ppb为0.106。则样品1的浓度范围0.675ppb-2.025ppb；样品2的浓度范围0.075ppb-0.0.225ppb。乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1的实际含量。
2、定量判定：
所获得的每个浓度标准溶液和样本吸光度值的平均值（B）除以第一个标准（0标准）的吸光度值（B0）再乘以100%，即百分吸光度值。
百分吸光度值（%）＝ B/B0×100%
B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值
B0—0ng/ml标准溶液的平均吸光度值
以标准品百分吸光率为纵坐标，以黄曲霉毒素B1标准品浓度（ng/ml）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中黄曲霉毒素B1实际浓度。
若利用试剂盒专业分析软件进行计算，更便于大量样品的准确、快速分析。
3、标准准曲线：
4、再现性：
由多个不同的实验结果确定了精密度，图2显示出黄曲霉毒素B1检测试剂盒的精密度情况，获得的标准吸收值的变异系数（%CV）对相应黄曲霉毒素B1浓度作曲线，可以看到在全部范围内变异系数如此之低，可以得到很好的再现性。
【注意事项】
1、使用前将所有试剂温度回升至室温20-25℃。试剂及标本没有回到室温（20-25℃）会导致所有标准的OD值偏低。
2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会伴随着出现标准曲线不成线性，重复性不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。
3、混合要均匀，否则会出现重复性不好的现象。
4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。
5、不要使用过了有效日期的试剂盒，稀释或搀杂使用会引起灵敏度、OD值的变化。不要交换使用不同批号的盒中试剂。
6、不用的微孔板放进自封袋密封；标准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。
7、显色液若有任何颜色表明变质，应当弃之。0标准的吸光度值小于0.5个单位（A450nm< 0.5 ）时，表示试剂可能变质。
8、该试剂盒最佳反应温度为25℃，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度发生变化。
【储存】
原包装应储存于2～8℃保鲜冷藏，切勿冷冻。
【有效期】
有效期12个月;生产日期、有效期、生产批号见外包装。
【备注】
如根据样品的国家允许量标准判定（详见附件表）；在样品测定前，用样品稀释液将样品提取液再进一步进行适当倍数稀释，即为待测样品液； 取50ul待测样品液进行定量或限量测定。
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