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逆转录试剂盒（cDNA 合成试剂盒）

发布时间：2025/7/11 10:53:59 阅读次数：1

CAT#:960906-50
低温运输,-20℃保存

逆转录试剂盒(cDNA 合成试剂盒)

产品及特点
本试剂盒提供合成 cDNA 第一链（逆转录）所需要的全部试剂。其原理是用突变的莫洛尼氏鼠白血病病毒反转录酶（M-MuLV RT）以 RNA 为模板，高效合成 cDNA。它具有下列特点：
1.   使用突变的反转录酶，内源 RNase H 活性低，使得在逆转录过程中 RNA 模板不容易被降解，得到的 cDNA 平均长度更长。
2.   最长可合成 13 Kb 的 cDNA。
3.   可以使用 oligo-dT、随机引物和 RNA 专一性引物三种引物（前两种本试剂盒提供）。
4.   总 RNA、poly(A)+RNA 或特殊 RNA 均可作为模板。
5.   得到的 cDNA 可用于后续的 cDNA 文库构建、 RT-PCR、探针标记等。
6.   本产品足够 50 次 20uL 体系的逆转录反应。
7.   本产品只能用于科研。

规格及成分    本产品使用五孔盒包装

成份            编号        规格        包装
MMLV（含 RI）        960906a        50 uL        0.5mL 红盖管
4×RT Buffer（含 dNTP）    960906b        250 uL        0.5mL 绿盖管
Oligo (dT)12-18 引物干粉    220629        25ug        0.5mL 白盖管
随机引物(6 碱基，无修饰)干粉    220574        10ug        0.5mL 黄盖管
超纯水            210806        1 mL        1.5mL 蓝盖管
使用手册            960906sc        1 份        无
注意：首次使用本产品时，需要在 Oligo (dT)12-18 引物干粉管中加入 50uL 超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到 0.5ug/uL 的 Oligo (dT)12-18 引物溶液；需要在随机引物 (6 碱基，无修饰) 干粉管中加入 50uL 超纯水，涡旋震荡半分钟混匀，得到 0.2ug/uL 的随机引物溶液。没有用完的引物需要放置在-20℃保存。
运输及保存：低温运输，-20℃保存，有效期一年。
使用方法    一：合成 PCR 用的 1st-strand cDNA
1.   在一干净的反应管中加入 RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因组 DNA 污染。
        RNA 模板种类        加入量
        总 RNA            100-500 ng
        或 poly(A) mRNA        10-500 ng
        或专一的 RNA    0.01 pg-500 ng
2.   加入引物和水

引物种类                    加入量
Oligo (dT)12-18 ，0.5 ug/uL            1 uL
或随机引物(6 碱基，无修饰)， 0.2 ug/uL        1 uL
或 RNA 模板专一性引物            15-20 pmol
注意：随机引物与 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平均长度成反比。
3.   加水到 13 uL 。
4.   70℃保温 5 分钟后立即冰浴，此步可以打开 RNA 的二级结构。
5.   再加入 5 uL 4×RT Buffer（含 dNTP）。
6.   37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保温 5 分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成 25℃ 5 分钟以便其跟 RNA 结合。
7.   加入 1 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20 uL。
8.   42℃保温 60 分钟。但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，待合成了一段 cDNA 后，然后再转移到 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
9.   70℃保温 10 分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作为 PCR 模板使用，不需要纯化。

二：合成建文库用的 1st-strand cDNA
1.   在一干净的反应管中加入 RNA 模板。注意：RNA 模板不能含有基因组 DNA 污染。
RNA 模板种类    加入量
poly(A) mRNA    1ug
或专一的 RNA    0.5-1 ug
2.   加入引物
引物种类                加入量
Oligo (dT)12-18 ，0.5 ug/uL        1 uL
或随机引物(6 碱基，无修饰)
0.2 ug/uL                1 uL
或 RNA 模板专一性引物        100 pmol
注意：随机引物与 RNA 模板的比例跟 cDNA 合成的平均长度成反比。
3.   加水到 13uL。
4.   70℃保温 5 分钟后立即冰浴，此步可以打开 RNA 的二级结构。
5.   再加入 5 uL 4×RT Buffer（含 dNTP）。
6.   37℃保温 5 分钟。对富含二级结构的高 GC RNA 模板，可以改成 45℃保温 5 分钟。如果使用随机引物，则改成 25℃ 5 分钟。
7.   加入 2 uL MMLV 逆转录酶（含 RI），反应终体积为 20uL。
8.   42℃保温 60 分钟，但如果使用随机引物，需要先 25℃保温 10 分钟，然后再转移到 42℃保温 60 分钟。此步为 RT 反应。
9.   70℃保温 10 分钟以终止反应，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以用于第二链 cDNA 的合成或放置在-20℃长期保存。