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组织法呢基焦磷酸合酶活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2025/7/11 12:05:56 阅读次数：1

组织法呢基焦磷酸合酶活性定磷比色法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
组织法呢基焦磷酸合酶活性定磷比色法定量检测试剂是一种旨在使用底物异戊烯焦磷酸和二甲烯丙基二磷酸，在法呢基焦磷酸合酶和无机焦磷酸酶作用下，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应后峰值的变化，即采用比色法测定单位酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适合于各种组织裂解悬液样品的法呢基焦磷酸合酶活性及其抑制剂的检测。产品不含污染性蛋白酶，严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，反应优化，检测敏感。

技术背景
法呢基焦磷酸合酶（Farnesyl diphosphate synthase；FDPS；EC2.5.1.10）为同源二聚体，分布在细胞质、线粒体、过氧化物体和叶绿体内，是类异戊二烯生物合成和甲羟戊酸通路的关键调节酶，提供倍半萜（sesquiterpene）前体，作为中间产物，用于多类必需代谢分子合成，例如类固醇、多萜醇（dolichols）、泛醌类（ubiquinones）、类胡萝卜素（carotenoids）等，以及用于法尼基化（farnesylation）和四异戊二烯化作用（geranylgeranylation）的底物，产生异戊二烯化蛋白（血红素、四异戊二烯焦磷酸），在成纤维细胞生长因子促成的信号通路上发挥作用。法呢基焦磷酸合酶催化异戊烯焦磷酸（isopentenyl diphosphate；IPP）和二甲烯丙基二磷酸（dimethylallyl diphosphate；DMAPP）的头尾序列缩合反应，产生法呢基焦磷酸（Farnesyl diphosphate；FPP）。法呢基焦磷酸合酶是多种疾病的药物靶标，包括骨质疏松症、高血压、心脏病、肿瘤、疟疾、查加斯病（Chagas disease）等。在植物中，该酶对于环境变化和食草动物或病原体攻击做出反应。基于底物异戊烯焦磷酸和二甲烯丙基二磷酸，在法呢基焦磷酸合酶的催化下，缩合产生法呢基焦磷酸和焦磷酸，进而使用无机焦磷酸酶（inorganic pyrophosphatase）的作用，释放出游离磷酸根，由硫酸亚铁氨还原产生钼蓝显色反应，在分光光度仪下（660nm波长）产生峰值的变化，由此测定法呢基焦磷酸合酶的活性。

产品内容
清理液（Reagent A）     60毫升
裂解液（Reagent B）        10毫升
缓冲液（Reagent C）     5毫升
阴性液（Reagent D）    3毫升
反应液（Reagent E）        400微升
显色液（Reagent F）        10毫升
标准液（Reagent G）    600微升
产品说明书        1份

保存方式
保存裂解液（Reagent B）、缓冲液（Reagent C）、反应液（Reagent E）和显色液（Reagent F）在－20℃冰箱里，避免反复冻融；其余的保存在4℃冰箱里；显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触；有效保证6月

用户自备
15毫升离心管：用于样品处理的容器
1.5毫升离心管：用于样品处理和保存的容器
（微型）台式离心机：用于样品收集
培养箱：用于孵育反应物
平式摇荡仪：用于混匀反应物
500微升1厘米光径比色皿或96孔板：用于比色的容器
分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤
实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂溶液放进冰槽里融化。然后进行下列操作。
一、样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重以确定200至500毫克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入3毫升清理液（Reagent A）清洗1次
4．移入到一个液氮冻存管
5．即刻放进液氮罐过夜
6．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
7．放进一个15毫升锥形离心管
8．加入预冷的200至500微升裂解液（Reagent B）
9．转移到预冷的1.5毫升离心管
10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11．置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
13．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
15．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备
1．准备好待测样品（例如组织裂解萃取液等），置于冰槽里（注意：样品须澄清）
2．设定好分光光度仪（温度为37℃）：波长为660nm，并置零
3．准备好5个1.5毫升离心管，标记为1至5号管
4．按下表分别加入阴性液（Reagent D）和标准液（Reagent G）到每个离心管，混匀
5．将1至5号管放进冰槽里备用，避免光照；标准管浓度见下表
管号    阴性液（Reagent D）    标准液（Reagent G）    测定体系标准磷浓度
1    0            200微升            200微摩尔/升
2    40微升            160微升             160微摩尔/升
3    80微升            120微升             120微摩尔/升
4    120微升            80微升             80微摩尔/升
5    200微升            0            0

三、标准曲线测定
1．移取200微升上述配制的标准液到新的比色皿
2．在30℃温度下孵育10分钟
3．加入200微升显色液（Reagent F），混匀
4．在37℃温度下孵育10分钟，避免光照
5．即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
6．重复实验步骤1至5四次
7．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）

四、样品背景测定
1．移取120微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入20微升待测样品（总量20微克组织裂解萃取液蛋白）
3．在30℃温度下孵育10分钟
4．加入60微升阴性液（Reagent D），混匀
5．加入200微升显色液（Reagent F），混匀
6．在37℃温度下孵育10分钟，避免光照
7．即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
8．根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）

五、样品活性测定
1．移取100微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入20微升待测样品（总量20微克组织裂解萃取液蛋白）
3．在30℃温度下孵育2分钟
4．加入20微升反应液（Reagent E）
5．在30℃温度下孵育10分钟
6．加入60微升阴性液（Reagent D），混匀
7．加入200微升显色液（Reagent F），混匀
8．在37℃温度下孵育10分钟，避免光照
9．即刻放进分光光度仪检测：获得吸光读数
10．根据标准曲线获得样品活性对应磷浓度（微摩尔/升）

六、计算样品活性
{[根据标准曲线获得样品对应磷浓度（微摩尔/升）—根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）]X 10（体系倍数）X样品稀释倍数}÷ 10（反应时间；分钟）＝纳摩尔磷/分钟/毫升
转换：纳摩尔磷/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔磷/分钟/毫克

七、酶标仪测定
1．在96孔板上做好相应标记：标准样品、样品背景、样品活性
2．分别移取100微升上述配制的标准液到相应的标准样品孔里
3．分别移取50微升缓冲液（Reagent C）到样品背景和待测样品孔里
4．分别加入10微升待测样品（总量20微克细胞裂解萃取液蛋白）到样品背景和样品活性孔里
5．加入10微升反应液（Reagent E）到样品活性孔里
6．加入10微升阴性液（Reagent D）到样品背景孔里
7．在30℃温度下，置于平式摇荡仪孵育10分钟，速度为50RPM
8．分别加入30微升阴性液（Reagent D）到样品背景和待测样品孔里
9．分别加入100微升显色液（Reagent F）到所有孔里
10．在37℃温度下，置于平式摇荡仪孵育10分钟，速度为50RPM，避免光照
11．即刻放进酶标仪检测：获得吸光读数
12．构建标准曲线：纵座标（Y轴）为吸光单位（A）；横座标（X轴）为标准磷浓度（微摩尔/升）
13．根据标准曲线获得样品对应磷浓度（微摩尔/升）
14．计算样品活性
{[根据标准曲线获得样品对应磷浓度（微摩尔/升）—根据标准曲线获得样品背景对应磷浓度（微摩尔/升）]X 10（体系倍数）X样品稀释倍数}÷ 10（反应时间；分钟）＝纳摩尔磷/分钟/毫升
转换：纳摩尔磷/分钟/毫升÷（样品蛋白浓度）毫克/毫升＝纳摩尔磷/分钟/毫克

注意事项
1．本产品为25次操作，包括5次（点）标准测定
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，标准曲线测定只需1条
4．样品背景读数大于1.0，建议稀释样品至0.5-1.0之间
5．显色液（Reagent F）具有腐蚀性，避免直接用手接触
6．样品切忌使用磷酸缓冲液、EDTA、EGTA和脱氧胆酸纳处理
7．比色测定后，比色皿须清洗彻底
8．如果用户没有660nm波长，可以使用600至660nm的任一波长替代
9．吸光读数增高，表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为20微克/20微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量；（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－G&VS30030.1）
11．法呢基焦磷酸合酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.4的情况下，每单位酶在单位时间内（每分钟）释放1微摩尔的磷
12．本公司提供系列法呢基焦磷酸合酶检测试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测准确

使用承诺
上海极威生物科技有限公司秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号            名称                规格
G&VS51019.2    组织法呢基焦磷酸合酶活性定磷比色法定量检测试剂盒    20次
G&VS51019.2A    清理液（Reagent A）                500毫升
G&VS51019.2B     裂解液（Reagent B）                100毫升
G&VS51019.2C    缓冲液（Reagent C）                50毫升
G&VS51019.2D     阴性液（Reagent D）            10毫升
G&VS51019.2E     反应液（Reagent E）                5毫升
G&VS51019.2F     显色液（Reagent F）                50毫升
G&VS51019.2G     标准液（Reagent G）            5毫升
G&VS30030.1    Bradford蛋白质浓度定量试剂盒             200次

试剂盒订购信息
产品编号            名称                        规格
G&VS51014.1    细胞法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性荧光定量检测试剂盒        20次
G&VS51014.2    组织法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性荧光定量检测试剂盒        20次
G&VS51014.3    细菌法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性荧光定量检测试剂盒        20次
G&VS51014.4    植物法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性荧光定量检测试剂盒        20次
G&VS51014.5    真菌/酵母法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性荧光定量检测试剂盒        20次
G&VS51018.1    细胞法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性光度法（360）定量检测试剂盒    20次
G&VS51018.2    组织法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性光度法（360）定量检测试剂盒    20次
G&VS51018.3    细菌法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性光度法（360）定量检测试剂盒    20次
G&VS51018.4    植物法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性光度法（360）定量检测试剂盒    20次
G&VS51018.5    真菌/酵母法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性光度法（360）定量检测试剂盒    20次
G&VS51019.1    细胞法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性定磷比色法定量检测试剂盒        20次
G&VS51019.2    组织法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性定磷比色法定量检测试剂盒        20次
G&VS51019.3    细菌法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性定磷比色法定量检测试剂盒        20次
G&VS51019.4    植物法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性定磷比色法定量检测试剂盒        20次
G&VS51019.5    真菌/酵母法呢基焦磷酸合酶（FDPS）活性定磷比色法定量检测试剂盒    20次