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铁含量（亚铁嗪比色法）检测试剂盒说明书微板法

发布时间：2025/7/14 11:54:22 阅读次数：29

铁含量（亚铁嗪比色法）检测试剂盒说明书微板法
有效期：3个月
建议正式实验前选取 2 个样本做预测定，了解本批样品情况，熟悉实验流程，避免实验样本和试剂浪费！

测定原理：
在酸性介质中铁从复合物中解离出来，再被还原剂还原成二价铁，并与亚铁嗪生成紫红色化合物，该有色物质在562nm处有特征吸收峰，进而计算得出铁含量。

需自备的仪器和用品：
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵和蒸馏水

试剂的组成和配制：
提取液：液体 100ml×1瓶，4℃保存；
试剂一：液体 30ml×1瓶，4℃保存；
试剂二：液体 3ml×1瓶，4℃避光保存；
试剂三：液体 20ml×1瓶，4℃保存；
标准品：液体 1ml×2瓶，10μg/ml铁标准品溶液，4℃保存；

样本制备：
1、组织样本：0.1g 组织样本，加 1mL 的提取液研磨，粗提液全部转移到 EP 管中， 12000rpm，离心 10min，上清液待测。
【注】：若增加样本量，可按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例提取
2、细菌/细胞样本：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；取 500 万细菌或细胞加入1mL 提取液；超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；于 4℃，12000g 离心 10min，取上清测定。
【注】：若增加样本量，可按细菌/细胞数量（10 4个）：提取液（mL）为 1000~5000：1 的比例进行提取
3、液体样品：澄清的样本可以直接检测。若样本浑浊离心 10min，上清液待测。

测定步骤：
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至562nm，蒸馏水调零。
2、铁标准曲线的制备：取 10μg/ml 的铁标准液用试剂三稀释成不同浓度：0.5μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、4μg/ml、 6μg/ml、8μg/ml、10μg/ml，进行标准曲线的制备。
浓度μg/ml        铁标准液（μl）    试剂三（μl）
0.5μg/ml        10        190
1μg/ml        20        180
2μg/ml        40        160
4μg/ml        80        120
6μg/ml        120        80
8μg/ml        160        40
10μg/m        200        0
3、加样表：在EP管中依次加入
试剂（μL）    空白管    标准管    测定管
样本                120
标准品            120
蒸馏水        120
试剂一        260    260    260
试剂二        20    20    20
        37℃反应10min
取200μl至微量石英比色皿/96孔板中，若浑浊则需3000rpm离心5min后，取200μL上清液至96孔板中，于波长562nm处读取吸光度A。

铁含量计算：
1、标准曲线的绘制以各标准溶液浓度为x轴，以其对应的吸光值（ΔA标准）为y轴，绘制标准曲线，得到标准方程y=kx+b，将 ΔA测定带入公式中得到x（μg/ml）。
2、铁含量计算
（1）按照样本蛋白浓度计算
铁含量（μg/mg prot）=x÷Cpr
铁含量（nmol/mg prot）=x÷Cpr×103÷Mr
（2）按照样本质量计算
铁含量（μg/g 鲜重）=x×V样总÷ W
铁含量（nmol/g 鲜重）=x×V样总÷ W×103÷Mr
（3）按照细胞数量计算
铁含量（μg/104cell）=x×V样总÷ 500
铁含量（nmol/104cell）=x×V样总÷ 500×103÷Mr
（4）按照液体体积计算
铁含量（μg/ml）=x
铁含量（nmol/ml）=x×103÷Mr
W：样本质量，g；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，蛋白浓度需自行测定； V样总：加入的提取液体积，1mL；500：细胞数量，500万； Mr：铁分子量，55.847

注意事项:
1.溶血样本对检测有干扰，尽量避免采用溶血样本。
2.玻璃器材需严格清洗，避免铁的污染，建议最好用一次性塑料试管。
3. 如果样品浓度过高，应用蒸馏水稀释后重测，结果乘以稀释倍数。