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HIS标签融合蛋白纯化试剂盒

发布时间：2025/7/14 12:02:23 阅读次数：17

HIS标签融合蛋白纯化试剂盒

将目标蛋白与 6xhis 融合表达，然后利用固定化的镍进行纯化，是比较经典的纯化路线。简单，快捷，纯度高。本试剂盒将亲合层析技术与离心柱技术相结合，提供了一种快速简便的融合蛋白纯化途径。
固定化 Ni 填料：Ni-Sepharose FF（Ameshame Pharmacia）结合载量：大于 10 mg /ml。
离心柱：小离心柱上样体积 0.7 ml，配套 2 ml 离心管。
样品处理量：每个样品纯化蛋白500µg-1mg；也可以根据样品量自由调节。
操作时间：小量纯化小于 30 分钟。

试剂盒组成
Mini spincolumn        10 支
Ni-Sepharose FF        1.5 ML
1 X PBS            10 ML
PNI20     (20mM Imidazole)    15 ML
PNI400   (400mM Imidazole)    3 ML

一、细胞的培养
1、挑取单菌落到 8 ml 2 X YTA 培养基，37℃震荡培养大约 5 小时至 A600 0.6-0.8。
2、根据载体使用说明，加入相应浓度诱导剂。一般 IPTG 的终浓度为 0.1-1mM.
3、诱导培养 2 小时。
4、离心收集菌体。去掉液体。
5、将菌体重悬于冰温的 1 X PBS。每 ml 培养物使用 50 微升 1 X PBS，8 ml 培养物使用 400 微升 1 X PBS。

二、细胞的裂解
1、加入溶菌酶溶液(10mg/ml)至终浓度 100 微克/ml（于 400 微升菌体悬液中加入 4 微升溶菌酶溶液）。并加入 DNase I 至终浓度 10 微克/ml。室温作用 10 分钟。
2、将样品于干冰或-80℃冰箱中冷冻 30 秒，马上防入 50℃温水浴中融化。这样重复冻融 5-10 次可完全裂解细胞。
3、14000rmp 离心 10 分钟，沉淀不溶物。将上清液用于后续纯化。

三、纯化
1 、将Ni-Sepharose FF震荡混匀，取150微升放入小离心柱，500g离心1分钟。加入600微升 PNI20 溶液，再次500g离心1分钟。此步目的是更换介质缓冲液。
2 、将细胞裂解液移入离心柱内，加盖，翻转几次，将吸附介质与样品混匀。重复翻转5分钟，以使介质与样品充分结合。500g离心1分钟。
3 、加入600微升 PNI20 溶液以漂洗介质，500g离心1分钟。
4 、加入100-200微升 PNI400 溶液以洗脱样品，室温作用10分钟。500g离心1分钟，收集洗脱液储存或分析。
注：
1 、在离心柱的离心步骤中，以能实现固液分离，Ni-Sepharose FF介质不过于干燥为宜。可根据情况适当调整离心速度和时间。
2 、重复一次PNI20 溶液漂洗，可以增加产物的纯度，同时也会降低产物的回收率。
3 、如果得率很低,可能是产物形成了包含体,应采取相应处理步骤(见精编分子生物学实验指南-变性条件下纯化带组氨酸尾的不溶性融合蛋白) 。