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新城疫病毒探针法 qRT-PCR 试剂盒

发布时间：2025/7/17 8:51:04 阅读次数：13

CAT#:JW-15-59300
低温运输，-20℃保存

新城疫病毒探针法 qRT-PCR 试剂盒

产品及特点
新城疫病毒(Newcastle Disease Virus, NDV) ，也叫禽副粘病毒 1 型，属于副黏病毒科禽副黏病毒属。新城疫病毒是 ssRNA 病毒，有包膜，病毒颗粒具多形性，有圆形、椭圆形和长杆状等，成熟的病毒粒子直径 100～400nm。新城疫病毒对外界环境的抵抗力较强，55℃作用 45min 和直射阳光下作用 30min 才被灭活。病毒在 4℃中存放几周，在-20℃中存放几个月或在-70℃中存放几年，其感染力均不受影响。新城疫是由新城疫病毒中强毒株引起禽的一种高度接触性染病，以高热、呼吸困难、下痢、神经紊乱、黏膜和浆膜出血为特征，具有很高的发病率和病死率，是危害养禽业的一种主要传染病。世界动物卫生组织将其列为法定报告疫病，我国将其列为一类进境动物疫病。因此对新城疫病毒的快速灵敏诊断具有重要意义。本产品以探针法荧光定量 RT-PCR 技术为基础开发的专门检测新城疫病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.   即开即用，用户只需要提供样品 RNA 模板。
2.   引物和探针经过优化，分析灵敏度高，可以达到 100 拷贝/反应。
3.   提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.   特异性高，引物是根据新城疫病毒 RNA 高度保守区设计，不会跟其他的 RNA 发生交叉反应。
5.   既用于定性检测，又用于定量检测。定量检测时线性范围至少为 5 个数量级。 6.   本产品足够 50 次20 μL 体系的探针法 qRT-PCR 反应。
7.   本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                编号        规格    包装
探针法 RT-PCR 缓冲液        990504a        0.5 mL    0.5 mL 蓝盖管
探针法 RT-PCR 酶混合液 v2        990504bv2    50 μL    0.5 mL 红盖管
荧光 PCR 模板专用稀释液        180701        1 mL    1.5 mL 绿盖管
新城疫病毒 qRT-PCR 引物-探针干粉    yp15-59300    50 次    1.5 mL 棕色管
新城疫病毒 qRT-PCR 阳性对照(1E7 拷贝/μL)pc59300-GQ901900    50 μL    0.5 mL 黄盖管
使用手册                15-59300sc    1份    无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入 165 μL 的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存：低温运输，-20℃保存，保存期限为24 个月。
自备试剂：样品 RNA ，超纯水。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以 1E1-1E6 拷贝/μL 这 6 个 10 倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的 DNA 片段作为阳性对照。
1.   标记 6 个离心管，分别为 6、5、4、3、2、 1。
2.   用带芯枪头分别加入 45 μL 荧光 PCR 专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.   在 6 号管中加入 5 μL1E7 拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡 1 分钟，得 1E6 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
4.   换枪头，在 5 号管中加入 5 μL1E6 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E5 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
5.   换枪头，在 4 号管中加入 5 μL1E5 拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡 1 分钟，得 1E4 拷贝/μL 的标准曲线样品。放冰上待用。
6.   重复上面的操作直到得到 6 稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。
二、样品 RNA 的制备
7.   如果有 N 个样品，最好设置 N+2 个提取，多出的一个是 PC（样品制备阳性对照），一个是 NC（样品制备阴性对照）。可以用 10 μL 上步所得 4 号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为 PC 。另外用水作为 NC。
8.   用自选方法纯化样品的 RNA，本试剂盒跟市场上大多数病毒 RNA 提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、设置 qRT-PCR 反应（20 μL 体系，在样品制备室进行）
9.   如果做定量分析并且只做 1 次重复，则标记 N+9 个 RT-PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品，1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板）， 6 个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做 1 次重复，则标记 N+4 个 RT- PCR 管，其中 N+2 个用于上步得到的 N+2 个样品， 1 个用于 RT-PCR 阴性对照（用水做模板），1 个用于 RT-PCR 阳性对照（直接用第 6 步第 4 号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10. 在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分    样品管    PCR 阴性    标准曲线

N+2 个                    对照管    样品管（1-6管）
探针法 qRT-PCR 缓冲液            10 μL    10 μL    各 10 μL
探针法 RT-PCR 酶混合液 v2            1 μL    1 μL    1 μL
新城疫病毒探针法 qRT-PCR 引物-探针混合液    3 μL    3 μL    各 3 μL
N+2 个待测RNA 模板                6 μL    不加    不加
超纯水                    不加    6 μL    不加
第 6 步所得标准曲线样品稀释液（2-6 号）        不加    不加    各 6 μL（1 号样到 1 号管，2 号样到 2 号管…）
11. 盖上盖子后上机，按下面参数进行 RT-PCR：

过程            温度    时间
逆转录            50℃    10 min
预变性            95℃    5 min
PCR 反应（40 个循环）    95℃    15 sec
            60℃    60 sec（采集 FAM 通道的荧光信号，淬灭基团为 TAMRA）
四、数据处理
12. 如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
13. 如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
14. 如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的 log 值为横轴，以 Ct 值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的 Ct 值从标准曲线上推算出样品 RNA 浓度的 log 值，再推算出其浓度。
15. 如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无 Ct 或 Ct 大于或等于 35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct 值应该小于 35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无 Ct 或 Ct 大于或等于 35，则为阴性。如果 Ct 小于 35 则为阳性。
关联产品：新城疫病毒(=禽副粘病毒 1 型)可视化染料-荧光染料 RT-LAMP 试剂盒