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组织GSK3β激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书

发布时间：2025/7/18 10:15:00 阅读次数：28

组织GSK3β激酶活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书

主要用途
组织GSK3β激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物，在GSK3α抑制剂的存在下，受到GSK3β磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应，即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化，以分析组织裂解样品中GSK3β特异活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种组织裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中GSK3β激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。

技术背景
糖原合成酶激酶3（glycogen synthase kinase 3；GSK3；EC 2.7.11.26）属于丝氨酸/苏氨酸激酶（serine/threonine protein kinase）家属成员之一。其目标蛋白为糖原合成酶和活化T细胞核因子（nuclear factor of activated T lymphocytes；NFAT），进行磷酸化后，抑制其功能，同时调控细胞对DNA损伤的反应、生物发育的组织排列（tissue patterning）、蛋白合成、细胞分化和繁殖等。糖原合成酶激酶3从酵母到人体高度进化保留，果蝇中GSK3同源蛋白为Shaggy（Zeste White 3），在Wnt信号通路中磷酸化β-catenin，导致后者泛素化后降解，防止β-catenin进入细胞核激活转录因子。糖原合成酶激酶3本身受到胰岛素、生长因子、蛋白激酶B（protein kinase B）/v-akt鼠源胸腺瘤病毒肿瘤基因同源体（akt）调控。糖原合成酶激酶3分成两种异构体：糖原合成酶激酶3α和β，其结构相似，功能不同。糖原合成酶激酶3β与tau蛋白磷酸化、能量代谢、神经细胞发育、机体形状构成等有关。糖原合成酶激酶3β功能异常将导致阿兹罕默综合征等疾病。其磷酸化目标序列为GPHRSTPESRAAV。基于底物GPHRSTPESRAAV，在ATP和GSK3α抑制剂Aloisine A的存在下，受到GSK3β激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析糖原合成酶激酶3β的特异活性。其反应方式为：

产品内容

清理液（Reagent A）     毫升
裂解液（Reagent B）     毫升
缓冲液（Reagent C）        毫升
酶促液（Reagent D）    微升
反应液（Reagent E）        微升
底物液（Reagent F）     微升
阴性液（Reagent G）    微升
产品说明书        1份

保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月

用户自备
GSK3β激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
（微型）台式离心机：用于组织预处理
比色皿或酶标板：用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析

实验步骤
一、待测样品准备
1．手术取出动物组织，并秤重500毫克组织重量
2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管
3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗
4．（选择步骤）抽去清理液
5．移入到一个液氮冻存管
6．即刻放进液氮罐过夜
7．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）
8．放进一个15毫升锥形离心管
9．加入置于冰槽里的xx微升裂解液（Reagent B）
10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀
11．放进冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）
12．即刻放进4℃台式离心机离心10分钟，速度为10000g
13．小心移取上清液到新的无菌的1.5毫升离心管
14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－JW-S30030.1）
15．放进－70℃的冰箱里保存或置于冰槽里备用

二、测定准备
1．准备好待测样品（例如组织裂解悬液等），置于冰槽里
2．设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3．缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升反应液（Reagent E）
4．加入xx微升底物液（Reagent F）
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入xx微升阴性液（Reagent G）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟

四、样品测定
1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2．加入xx微升酶促液（Reagent D）
3．加入xx微升反应液（Reagent E）
4．加入xx微升底物液（Reagent F）
5．放进30℃培养箱里静置3分钟
6．加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7．上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8．即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟－340波长读数5分钟

五、计算样品活性

六、酶标板测定
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中
3．分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
4．分别加入xx微升反应液（Reagent E）
5．分别加入xx微升底物液（Reagent F）
6．轻轻摇动96孔酶标板
7．在30℃温度下孵育3分钟
8．分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
9．轻轻摇动酶标板
10．即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11．活性计算：

七、抑制剂筛选
1．在96孔酶标板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2．按下表加入试剂，进行样品预处理
内容物             空背景对照     样本背景     完全酶活性     待测抑制剂酶活性
缓冲液（Reagent C）     xx微升           xx微升    xx微升         xx微升
阴性液（Reagent G）     xx微升              xx微升    xx微升            ——
待测抑制剂         ——               xx微升    ――                    xx微升
用户自备的纯化酶         ——              ——    xx微升（1毫单位）    xx微升（1毫单位）
96孔板每孔总量     空背景对照孔（xx微升）     样本背景孔（xx微升）     完全活性孔（xx微升）     待测抑制剂样品孔（xx微升）
轻轻摇动酶标板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作

3．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4．分别加入xx 酶促液（Reagent D）
5．分别加入xx微升反应液（Reagent E）
6．分别加入xx微升底物液（Reagent F）
7．轻轻摇动酶标板
8．在30℃温度下孵育3分钟
9．加入20微升上述预处理的待测样品
10．即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
11．抑制活性计算：

注意事项
1．本产品为20次操作，包括背景操作
2．操作时，须戴手套
3．系统操作过程中，背景测定只需1次
4．样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5．样品须澄清，至关重要
6．加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
7．测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
8．光谱测定后，比色皿须清洗彻底
9．样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
10．建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－JW-S30030.1）
11．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12．可以使用GSK3β抑制剂噻二唑烷酮-8（thiadiazolidinone-8；TDZD-8）作为抑制剂对照或阴性对照
13．糖原合成酶激酶3β活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
14．本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品

质量标准
1．本产品经鉴定性能稳定
2．本产品经鉴定检测敏感

使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。

友情提醒
IF IT DOESN’T WORK， RECHECK YOUR EXPERIMENT TO SEE WHAT YOU DID WRONG。

订购信息
单组分订购信息
编号        名称                    规格
JW-S50161.4.3    组织GSK3β激酶活性光谱法定量检测试剂盒        20次
JW-S50161.4.3A    清理液（Reagent A）                100毫升
JW-S50161.4.3B    裂解液（Reagent B）                100毫升
JW-S50161.4.3C     缓冲液（Reagent C）                50毫升
JW-S50161.4.3D    酶促液（Reagent D）            5毫升
JW-S50161.4.3E     反应液（Reagent E）                5毫升
JW-S50161.4.3F    底物液（Reagent F）                5毫升
JW-S50161.4.3G    阴性液（Reagent G）            5毫升

试剂盒订购信息
产品编号        名称                    规格
JW-S50054.1    细胞Akt1/PKB激酶活性光谱法定量检测试剂盒    20次
JW-S50054.2    组织Akt1/PKB激酶活性光谱法定量检测试剂盒    20次
JW-S50054.3    细胞Akt2/PKBβ激酶活性光谱法定量检测试剂盒    20次
JW-S50054.4    组织Akt2/PKBβ激酶活性光谱法定量检测试剂盒    20次
JW-S50054.5    细胞Akt3/PKBγ激酶活性光谱法定量检测试剂盒    20次
JW-S50054.6    组织Akt3/PKBγ激酶活性光谱法定量检测试剂盒    20次
JW-S50161.1    细胞GSK3α激酶活性光谱法定量检测试剂盒        20次
JW-S50161.2    组织GSK3α激酶活性光谱法定量检测试剂盒        20次
JW-S50161.3    细胞GSK3β激酶活性光谱法定量检测试剂盒        20次
JW-S50161.4    组织GSK3β激酶活性光谱法定量检测试剂盒        20次
JW-S50161.5    细胞GSK3激酶总活性光谱法定量检测试剂盒        20次
JW-S50161.6    组织GSK3激酶总活性光谱法定量检测试剂盒        20次