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UNG RT-LAMP MasterMix（荧光染料法）

发布时间：2025/8/26 16:41:16 阅读次数：22

CAT#:JW-211213-50
低温运输，-20℃保存

UNG RT-LAMP MasterMix（荧光染料法）

产品及特点
RT-LAMP MasterMix（荧光染料法）含有荧光RT-LAMP扩增所需的所有成分，可以用于实时荧光RT-LAMP等温扩增。RT-LAMP即Reverse Transcription Loop-Mediated Isothermal Amplification（逆转录-环介导等温扩增），它利用4条模板专一的特异引物、逆转录酶和具有链置换能力的Bst DNA 聚合酶，在等温条件下(65℃左右)30－60分钟完成逆转录和LAMP扩增。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于定性RT-PCR技术，还不需要昂贵的仪器设备。目前已成功应用于生物的快速检测，广泛用于各个领域。本试剂盒具有下列特点：
1.即开即用，含有LAMP专用的荧光染料，可以进行实时荧光检测（需要荧光PCR仪），但不建议用于定量分析。
2.含UNG防污染系统。
3.高特异性，精心优化的配方，非特异扩增比自配的试剂更低。
4.高扩增效率，一般比RT-PCR灵敏一个数量级。
5.65℃左右同时完成逆转录和等温扩增，一步式操作。
6.本试剂盒足够50次20 mL体系的实时荧光RT-LAMP扩增。
7.提供扩增对照，便于在遇到困难时分析原因。
8.20 mL体系最多可以使用13 mL样本，减少漏检。
9.本产品只能用于科研，不能用于临床。

规格及成分
本试剂盒使用五孔盒包装
成份                                    编号                规格               包装
UNG RT-LAMP MasterMix
（荧光染料法，待加酶）    211213                200 mL    0.5 mL黄盖管
逆转录酶-扩增酶混合液    211208                100 mL    0.5 mL红盖管
LAMP阳性对照模板-引物混合物    220402    50 mL    0.5 mL蓝盖管
超纯水，PCR级                   210806               1 mL      1.5 mL本色盖
石蜡油，PCR级                  220101              1.5 mL    1.5 mL本色盖
使用手册                       211213sc               1份               无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
RNA模板、RT-LAMP引物

使用方法
1.制备模板RNA：用于选用合适的方法制备模板RNA。如果有N个样品，最好设置N+2个样品制备，多出的两个一个是样品制备阳性对照，一个是样品制备阴性对照。
2.配制20×RT-LAMP引物混合液。
先加超纯水将合成的HPLC级别的下列引物干粉稀释到下表所标注的母液浓度，然后在一新的离心管中按表中所列体积加入各种引物母液和超纯水，最后得到0.1 mL的20×RT-LAMP引物混合液，此混合液足够100次20 mL体系的RT-LAMP扩增。如果需要配制的20×RT-LAMP引物混合液体积异于0.1 mL，则各成分的用量请按比例调整。引物混合液可以在-20℃放置2年。
引物名称    母液浓度    加母液量    在20×LAMP引物混合液中的浓度
FIP引物    100 mM    32 mL    32 mM
BIP引物    100 mM    32 mL    32 mM
F3引物    100 mM    4 mL    4 mM
B3引物    100 mM    4 mL    4 mM
Loop F    100 mM    8 mL    8 mM
Loop B    100 mM    8 mL    8 mM
超纯水    -    12 mL    -
终体积    -    0.1 mL    -
注：如果没有Loop引物，则用水替代。
3.在冰上融化RT-LAMP MasterMix（荧光染料法，待加酶），混匀，稍离心。第一次使用时，请将100 mL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix中并轻柔颠倒混匀1分钟，然后再使用。如果有N个样品，则在N+2个反应管中加入以下组份，多出的一管是RT-LAMP扩增阳性对照（PC），一管是RT-LAMP扩增阴性对照（NC）：
成份            N+2个样品管    RT-LAMP扩增PC    RT-LAMP扩增NC
UNG RT-LAMP MasterMix
（荧光染料法，加酶后）    6 mL        6 mL        6 mL
自备20×RT-LAMP
引物混合液        1 mL        不加        1 mL
阳性对照模板-引物混合物    不加        4 mL        不加
自备RNA模板        1-13 mL        不加        不加
补自备超纯水到        20 mL        20 mL        20 mL
4.混匀，放荧光定量PCR仪器上65℃保温90分钟，每分钟采集一次SYBR通道的荧光信号。
5.反应结束后，按下面的步骤处理和分析数据。
6.阈值的设定：LAMP的阈值跟LAMP引物的专一性密切相关，因此新设计的引物需要先在不加模板的情况下进行LAMP扩增，测定其Ct。Ct最好没有，如果有也最好不要低于60（每分钟采集一次荧光信号的话）。如果低于60，则最好重新设计引物。
7.实验有效性的判断：如果阈值设定为60，则样品制备阳性对照和扩增阳性对照的Ct应该在60以内，样品制备阴性对照、无模板阴性对照和无引物无模板阴性对照的Ct应该大于60，否则提取实验或扩增实验无效。对无效的实验不需要分析样品的结果，需要寻找原因或跟厂家联系。
8.如果实验有效，则可以分析样品的数据。样品Ct小于阈值则判读为阳性，大于阈值则判读为阴性。

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