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MBP麦芽糖结合蛋白纯化试剂盒

发布时间：2025/9/1 13:55:34 阅读次数：11

CAT#:JW-220170
常温运输和保存

MBP麦芽糖结合蛋白纯化试剂盒

产品及特点
MBP（麦芽糖结合蛋白，Maltose Binding Protein）标签蛋白大小为40 kDa，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加在细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核蛋白。如果蛋白在细菌中表达，MBP可以融合在蛋白的N端或C端。MBP融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化，结合的融合蛋白可用10 mM麦芽糖在生理缓冲液中进行洗脱。如果要去除MBP融合部分，可用位点特异性蛋白酶切除。可用MBP抗体或表达的目的蛋白特异性抗体检测MBP标签标记的重组蛋白。由于MBP融合蛋白原核表达载体具有表达效率高，易于纯化等优点。在现代分子克隆中MBP常作为融合蛋白被广泛应用。本产品就是专门用于分离纯化MBP融合蛋白的试剂盒，它具有下列特点：
1.一站式套装，含所需直链淀粉和琼脂糖介质、溶液和层析柱，操作非常方便。
2.提供2 mL的直链淀粉-琼脂糖介质，其最大载量为10 mg MBP蛋白/mL介质。
3.采用麦芽糖温和洗脱，无去污剂和变性剂对蛋白活性的影响。
4.本试剂盒足够20次制备，但介质可以反复使用更多次（需要复活）。
5.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                       编号       规格      包装
直链淀粉-琼脂糖介质        220170a    2 mL      5 mL本色瓶
1 M Tris-HCl（pH7.4）    25-07640    25 mL    30 mL本色瓶
0.1 M EDTA溶液                 131181    25 mL    30 mL本色瓶
2 M NaCl溶液                25-06280    50 mL    60 mL本色瓶
蔗糖                                    57-50-1    20 g     30 mL本色瓶
PMSF（10 mg/mL）        100833 1 mL    2.0 mL白盖管
0.1 mM MgCl2溶液       220170b   50 mL    60 mL本色瓶
0.1 M麦芽糖溶液         220170c   25 mL    30 mL本色瓶
层析柱（6 mL）              110809 1支       1袋
使用手册                        220170sc    1份        无
本产品采用大扁盒包装

运输及保存
常温运输和保存，但介质需4℃保存，PMSF需要-20℃保存，有效期一年。

自备物品
去离子水、20%乙醇、0.22 mm 或0.45 mm滤膜、自备透析袋（规格需小于MBP麦芽糖结合蛋白分子量）

使用方法
1.将直链淀粉-琼脂糖介质充分混匀后，取适量加入到预放了一片筛板的层析柱中（介质用量需要根据MBP蛋白产量决定，其最大载量为10 mg MBP蛋白/mL介质，请根据实验需要取适量的介质加入层析柱中）。
2.用5倍柱体积（柱体积指的是填料介质的体积，下同，本试剂盒介质的体积是2mL）自备去离子水洗柱，共3次。
3.用5倍柱体积（约10 mL）的新配的结合缓冲液洗柱，进行平衡，使填料介质处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用。结合缓冲液的配方如下（以10 mL为例）：
成分            用量    在结合缓冲液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）    0.2 mL    20 mM
0.1 M EDTA溶液        0.1 mL    1 mM
2 M NaCl溶液        1 mL    200 mM
自备去离子水        8.7mL    -
4.4℃ 5000 g离心10分钟收集20 mL表达菌液，弃上清，将细胞沉淀（约100 mg）悬于2 mL冰冷的现配的细胞洗涤液中，4℃ 5000 g离心15分钟收集细胞沉淀后，再次悬于2 mL冰冷的细胞洗涤液中。（最好用不加诱导物的菌液做对照样。）细胞洗涤液的配方如下（以10 mL为例）：
成分                                   用量        在细胞洗涤液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）    0.1 mL    10 mM
2 M NaCl溶液                  0.15 mL    30 mM
自备去离子水                  9.75 mL    -
5.制备细胞裂解物：
1)如果所用载体不带MBP信号肽序列（如pMAL-c2）
a)超声破碎细胞，功率30 W，保持细胞低温（0℃），直到在显微镜下看见绝大多数细胞破裂。（超声参数需根据仪器型号自行摸索，但裂解物必须不粘稠，否则会堵塞层析柱。）
b)为使溶液澄清，向上述细胞洗涤液中加入35 mL PMSF（10 mg/mL）。
c)4℃下13000-15000 g离心30分钟，以去除残留细胞和细胞碎片以防堵柱，收集上清样品，留样做 SDS-PAGE 电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
2)如果所用载体带MBP信号肽序列（如pMAL-p2）
a)4℃ 5000 g离心15分钟收集细胞，沉淀悬于1 mL冰冷的现配的细胞裂解液中。细胞裂解液的配方如下（以10 mL为例）：
成分            用量    在细胞裂解液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）    0.3 mL    30 mM
0.1 M EDTA溶液        0.01 mL    0.1 mM
蔗糖            2 g    20%（m/V）
自备去离子水        加水到10 mL    -
b)加入25 mL PMSF（10 mg/mL），室温搅动15分钟，于4℃ 13000-15000 g离心10分钟收集细胞。
c)旋动细胞沉淀，加入2 mL冰冷的0.1 mM MgCl2溶液，4℃搅动10分钟。
d)休克细胞4℃ 13000-15000 g离心10分钟，在上清中加入10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（可将1 M Tris-HCl，pH 7.4稀释100倍配制而成）至pH为7.4。
e)上清用0.22 mm 或0.45 mm滤膜过滤，滤液用100倍体积的10 mM Tris-HCl（pH 7.4）（配方如上）使用自备透析袋4℃透析。
f)收集透析后样品，留样做 SDS-PAGE 电泳对照，其余样品用于纯化MBP融合蛋白，直接进入第6步。
6.将样品加到平衡好的直链淀粉-琼脂糖介质中（保证目的蛋白与介质充分接触，以提高目的蛋白的回收率），收集流出液。
7.用10-15倍柱体积的结合缓冲液（配方见上表）进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液。
8.使用5-10倍柱体积的现配的麦芽糖洗脱液洗脱结合的融合蛋白，收集洗脱液（即目的蛋白组分）。麦芽糖洗脱液的配方如下（以10 mL为例）：
成分                                  用量    在麦芽糖洗脱液中的浓度
1 M Tris-HCl（pH 7.4）    0.2 mL    20 mM
0.1 M EDTA溶液       0.1 mL    1 mM
0.1 M麦芽糖溶液             1 mL    10 mM
自备去离子水                8.7 mL    -
9.将纯化得到的样品（包括流出液、洗杂液和洗脱液）以及原始样品使用SDS-PAGE检测纯化效果。
10.填料介质清洗：依次使用3倍柱体积结合缓冲液和5倍柱体积去离子水平衡介质，最后再用5倍柱体积的20%的乙醇平衡，然后保存在等体积的20%的乙醇中，置于4℃保存，防止填料被细菌污染。本介质可重复使用。
11.蛋白酶切割释放靶蛋白（可选步骤，所用试剂需自备）：用适当的蛋白酶切割融合蛋白释放靶蛋白。
1)加入自备的凝血酶、肠激酶或Xa因子（根据融合蛋白中的位点选择）。每毫升介质中加入50单位的溶于1 mL PBS溶液的蛋白酶。颠倒离心管数次混匀，室温下振荡2-16小时。
2)4℃以500 g离心5分钟，上清小心转移到新离心管中。
3)用传统的层析方法或SDS-PAGE电泳分离靶蛋白和蛋白酶。

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