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随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒

发布时间：2025/9/5 15:48:13 阅读次数：14

CAT#:JW-220315-5
低温运输、-20℃保存

随机引物法DNA探针生物素标记试剂盒

产品及特点
本产品是基于Feinberg和Vogelstein发明的随机引物标记法而开发出来的即用型DNA探针标记试剂盒，标记过程由双链DNA热变性、随机引物与单链DNA结合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探针并掺入标记的核苷酸三步组成，可用下面的示意图表示：

本产品对Feinberg和Vogelstein经典方法进行了改良，具有下列特点：
1.提供的标记反应液整合了除酶和模板外的所有成分，简化了反应加样步骤，提高了标记反应的可重复性。
2.使用无外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已标记DNA探针不会被酶降解，探针产量更高。
3.快速，最快1小时即可完成标记反应。
4.所需模版DNA量少，模板可以是线状或环状的、也可以是单链或双链的，但长度必须在100 bp以上。
5.得到的探针长度一般在200-400 nt之间（如果模板长度在1kb以上），可以用于Southern杂交、Northern杂交、原位杂交、菌落和斑点印迹杂交等。
6.本产品足够5次DNA模板的生物素标记实验。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成份                                                编号        规格    包装
2×随机引物生物素标记反应液    220315a    50 uL    0.5mL绿盖管
Klenow exo-聚合酶，2U/uL     220315b   5 uL     0.5mL红盖管
超纯水                                        210806      1 mL    1.5mL蓝盖管
使用手册                                   220315sc    1份        无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，有效期一年。

自备试剂
需要自备标记的核苷酸。

使用方法
1.在一干净的硅化的塑料离心管中加入下列成分：
成分            用量
模板DNA            50-150 ng
2×随机引物生物素标记反应液    10 uL
超纯水            补水到19 uL
注意：非同位素标记基团（如生物素和地高辛）疏水性强，易与塑料离心管表面非特异性结合，所以要硅化塑料离心管。模板DNA并非越多越好，否则没有标记的模板DNA在杂交时会竞争性地抑制标记DNA跟靶分子的杂交，反而降低杂交信号强度。
2.沸水浴10分钟，或在PCR仪上100℃加热10分钟彻底变性模板DNA，结束后需要立即放冰上待用。不能缓慢降温，否则变性的模板DNA单链又会杂交形成双链。
3.离心数秒使所有液体集中在管底，再加入1 uL Klenow exo DNA聚合酶。
4.轻柔吹打混匀。如有液滴沾在管壁上，离心数秒使所有液体集中在管底。
5.37℃保温1-20小时。标记效率跟模板量和保温时间相关，杂交需要一定量的探针，同时在杂交时探针模板比越高，没有标记的模板DNA对杂交的竞争性抑制越低。用户需要在这两者之间进行折衷选择。具体可以参考下表：
模版DNA用量（ng）    1小时后探针合成量/探针模板比    20小时后探针合成量/探针模板比
10                                    80ng/8                                                900ng/90
30                             150ng/5                                1350ng/45
100                  350ng/3.5                                    1650ng/16.5
300                   750ng/2.5                                 2200ng/7.3
1000                    1300ng/1.3                              2600ng/2.6
3000               1600ng/0.53                               2600ng/0.87
6.反应结束后加热100℃ 5分钟使DNA聚合酶变性，同时使DNA探针变性成单链。变性后的标记反应液可以放-20℃长期保存，也可以直接加入到杂交反应液中进行杂交。如果电泳检测，标记产物将是弥散状态。
注意：本方法标记核苷酸掺入率极高，因此可以不经纯化直接使用。如果需要纯化，不要用酚抽提法纯化非同位素标记的DNA探针，因为这些标记分子（如生物素或地高辛等）疏水性强，能使标记的DNA进入疏水的有机相而丢失。只能选择乙醇直接沉淀或Sephadex G50过柱回收（需另购柱式探针纯化试剂盒）。对比活高的同位素标记探针，由于同位素其极其不稳定，因此应该立即使用，不要长久放置。

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