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植物线粒体DNA纯化试剂盒

发布时间：2025/9/8 11:18:10 阅读次数：17

CAT#:JW-220350-5
常温运输及保存

植物线粒体DNA纯化试剂盒

产品及特点
植物线粒体是重要的植物细胞器，负责ATP的产生。此外植物很多重要的特性(如雄性不育)也跟线粒体相关，是母系遗传研究的重要材料。而对植物线粒体进行遗传研究需要进行线粒体DNA纯化。本产品就是专门用于植物细胞线粒体DNA纯化的试剂盒，它具有下列特点：
1.即用型试剂盒，用户不需要单独配制各种溶液。
2.提供粗提和精提两种操作方案，粗提利用常规台式冷冻离心机的差速分离原理进行线粒体粗提，所得线粒体含少量其他细胞器污染，可用于后续的PCR级别的线粒体DNA提取。
3.精提利用冷冻超速离心（离心力达40000×g）制备的密度梯度来将粗提制备的线粒体和其他细胞成分进一步分开，得到线粒体精提液，适用于后续的测序级别的线粒体DNA提取。
4.本产品足够5次提取，每次可处理10 g绿色植物组织（可得1-2.5 mg左右线粒体）或20 g非绿色植物组织（可得2-5 mg左右的线粒体）。
5.本产品只能用于科研。

规格及成分
成分                                             编号        规格                包装
植物线粒体提取匀浆液                211250a    250 mL    250 mL本色瓶
植物线粒体提取洗涤液              211250b    2×250 mL    250 mL本色瓶
植物线粒体提取离心介质溶液   211250c    150 mL          250 mL本色瓶
Percoll                                       211251      50 mL    60 mL本色瓶
BSA干粉                                    211248      1 g               5 mL本色瓶
带柄尼龙筛                              211250d    1个              塑料袋
软毛笔                                  211250e    1只              自有包装
詹纳斯绿B染色液（0.2%）    221107d    1 mL                1.5 mL棕色管
DNase A干粉                              211249    1 mg              0.5 mL黄色盖
细胞器DNA纯化溶液A      220350a    3 mL              5 mL本色瓶
细胞器DNA纯化溶液B            220350b    750 μL             1.5 mL本色盖
使用手册                                 220350sc    1份                无
本产品采用大扁盒包装

运输及保存
常温运输及保存,有效期一年。

自备试剂
超纯水、5 M KOH（调pH用），25 mM MgCl2溶液、0.5 M EDTA溶液、氯仿、异丙醇、75%乙醇、TE缓冲液或超纯水。

使用方法
注意：线粒体膜对温度高度敏感，所以整个操作必须在冰上或者在冷室进行，所用植物组织，器皿和溶液均需要在4℃预冷。任何情况下线粒体的温度都不要超过4℃。

一、选择植物组织
1.植物组织不同，线粒体产率不同，请以下表为参考：
植物组织种类                                  线粒体产率    说明
根和块茎                                       0.3 mg/10 g   如土豆，红薯等
黄化苗（下胚轴、子叶、胚芽鞘）      2-5 mg/10 g    多酚含量低于叶片
有光合作用的叶片和子叶                  1-2.5 mg/10 g    需放置在暗处3天
2.一般纯化最好选用黄化苗。如果用绿色组织（如叶片），需将植物提前放在暗室至少3天以降低淀粉含量，否则淀粉颗粒将干扰线粒体的纯化。
3.一次实验需要10 g绿色植物组织（或20 g干净的非绿色植物组织）、40 mL植物线粒体提取匀浆液、约90 mL植物线粒体提取洗涤液和35 mL植物线粒体提取密度梯度离心介质（密度梯度离心介质的配制方式是一次性将9.8 g=8.7 mL Percoll加入到26.3 mL本试剂盒提供的植物线粒体提取离心介质溶液中，充分混匀后得到35 mL植物线粒体提取密度梯度离心介质）。上述三种溶液用前均需要加入BSA干粉使其终浓度为0.1%（100 mL溶液加0.1 g BSA干粉，轻柔颠倒混匀或搅拌溶解后放冰上预冷待用）。每次实验用多少配多少，不要预先将所有BSA干粉加入，否则容易长菌。

二、线粒体粗提操作流程
4.将10 g的绿色植物组织（去叶脉后的嫩叶子、愈伤组织）或20 g干净的非绿色植物组织（如发芽组织、根、块茎等）浸泡在冰水中10分钟，取出用纸吸干液体后浸泡在预冷的40 mL匀浆液（已加0.1% BSA）中，在浸泡状态下剪成1 cm2大小的碎片。注意：处理样品量太大的话线粒体产率会急剧降低，所以如果同一样品太多可分成多组平行处理，得到线粒体粗提物后再汇集。
5.将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到Waring匀浆器中，中速匀浆3次，每次15秒，每次之间间隔10秒以便让碎片沉淀到刀片处。也可使用研磨法，具体操作是将匀浆液和其中的植物组织碎片转移到预冷的研钵中，研磨3-4分钟。注意：植物组织匀浆后释放的物质会使匀浆液酸化，降低pH，而线粒体对pH变化非常敏感，因此建议匀浆后用pH试纸检测匀浆液的pH，如果低于7.0，必须用自备的5 M KOH将pH调到7.0以上才进入下一步。
6.用带柄尼龙筛过滤匀浆液，穿透液可通过预冷的漏斗收集到预冷的50 mL的塑料离心管中。带柄尼龙筛可以洗干净后可以反复使用。
7.在低速固定角度冷冻离心机上4℃ 1000×g离心5分钟，沉淀为未破碎的细胞、破碎细胞的碎片、细胞核和淀粉颗粒，上清含线粒体。小心转移上清到新的预冷的50 mL塑料离心管中。
8.将装上清的离心管在水平冷冻离心机上4℃ 12,000×g离心20分钟，弃上清液，所得棕绿色沉淀即为纯化的线粒体粗提物。有时沉淀底部还有白色的淀粉沉淀，属于正常现象。
9.加入10 mL预冷的植物线粒体提取洗涤液（已加0.1% BSA，下同）中，用软毛笔轻柔重悬线粒体沉淀(如果最底下有白色淀粉沉淀，需要避免重悬之)。不能剧烈震荡，否则线粒体容易破裂。
10.将线粒体重悬液转移到新的50 mL离心管中，再加入30 mL预冷的植物线粒体提取洗涤液，4℃ 1000×g离心5分钟。线粒体将在上清中。
11.将上清转移到新的预冷的50 mL离心管中，4℃ 12000×g离心20分钟，沉淀为线粒体。小心弃上清。到此步时，线粒体回收率一般在15-30%。
12.在沉淀中加入2 mL预冷的植物线粒体提取洗涤液。用软毛笔轻柔重悬，得到线粒体粗提液。如果有平行提取，可将最多4管线粒体沉淀重悬在2 mL植物线粒体提取洗涤液中。线粒体粗提液中线粒体的回收率一般在45-75%。
13.在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50 μL左右的线粒体粗提液到载玻片上，再滴入50 μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
14.所得线粒体粗提液含其他细胞器（如类囊体膜,质体,过氧化物酶体，乙醛酸循环体,或细菌）污染，但可直接用于PCR级线粒体DNA和RNA的提取。如果需要长期保存，则直接放-80℃保存。如此保存的线粒体DNA完整性在几年内都不会发生变化。

三、细胞核DNA的去除（纯化测序级的线粒体DNA才需要进行此操作）
15.预留50 μL线粒体粗提液做对照，在约2 mL剩余的线粒体粗提液中加入40    μL 25 mM自备的MgCl2，再加入0.2 mg DNase A干粉，混匀后冰上放置60分钟降解DNA。取少量样品（如50 μL）在PCR仪器中加热到95℃变性10分钟灭活DNase，再取其中的10 μL和10 μL预留的样品一起进行细胞核基因专一性PCR（需要用户自己设计引物和自备PCR试剂），如果DNase处理过的样品没有扩增，而预留样品有扩增，则表明DNA去除比较干净（达到PCR检测的极限），则进入下一步。如果未去除干净，则继续在冰上放置，直到PCR检测不到细胞核DNA。
16.加入0.32 mL预冷的自备0.5 M的EDTA溶液和40 mL预冷的植物线粒体提取洗涤液。
17.4℃ 1000×g离心5分钟，将上清转移到新的预冷的50 mL离心管中，4℃ 12000×g离心20分钟，沉淀为去除细胞核DNA的线粒体。重悬在2 mL植物线粒体提取洗涤液中。
18.在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50 μL左右的线粒体粗提液到载玻片上，再滴入50 μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。

四、线粒体精提操作方案（需要40000×g的超速冷冻离心机）
19.在50 mL预冷的塑料离心管中先后加入35 mL预冷的植物线粒体提取密度梯度离心介质（配制方法见第三步，用前需先加0.1% BSA）。
20.将2 mL线粒体粗提物重悬液铺在植物线粒体提取密度梯度离心介质上。
21.在超速水平离心机上4℃ 40,000×g离心45分钟，最上层为黄色或橙色的质体带（如果材料是绿色植物，此带将是绿色），其下的白色不透明的带即为线粒体，管底沉淀为过氧化物酶体。其示意图如下：
22.用广口吸管（可将1 mL蓝抢头中间剪断后使用）收集线粒体带，注意避开其上的质体带过氧化物酶体沉淀，估计所取含线粒体溶液的体积。
23.在15-20分钟的时间内缓慢加入至少4倍体积的预冷的植物线粒体提取洗涤液。
24.转入50 mL塑料管离心管中，在冷冻离心机上4℃ 15,000×g离心20分钟，沉淀为线粒体。可以直接进入第25步进行DNA提取。如果暂时不提取DNA，则把线粒体沉淀放-80℃保存。
五、线粒体DNA的提取
25.在线粒体沉淀中加入600 μL预热的细胞器DNA提取溶液A，用移液枪充分吹打均匀。
26.再加入150 μL 65℃预热的细胞器DNA提取溶液B，颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。由于溶液B比较粘稠，可以采取称量方法取用，150 μL约等于150-160 mg。也可以将1 mL枪头剪去一截再吸取。
27.65℃放置5分钟。不能室温放置，否则DNA产量会降低10-20%。
28.加入200 μL自备氯仿，涡旋震荡混匀30秒，此时溶液将呈乳白色。
29.14000×g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5 mL塑料离心管中，避免触及中间层的白膜。
30.加入1倍体积(约750 μL)的异丙醇到上清液中，用手上下颠倒30秒混匀。此时一般将有絮状DNA沉淀出现。
31.14000×g室温离心3分钟。此时管底将有微小DNA沉淀，小心弃上清，注意不要丟弃DNA沉淀。
32.在离心管中加1 mL 75%乙醇，短暂震荡，14000×g室温离心3分钟，弃上清。
33.重复上述75%乙醇洗涤操作一次。
34.短暂离心，小心吸弃残留的液体（约50 μL）。此步不要省略，否则残留的液体（含乙醇）将会影响DNA电泳、酶切很PCR等反应。
35.立即加入50-100 μL TE缓冲液或超纯水充分溶解线粒体DNA沉淀。
36.直接取5-10 μL电泳检测DNA，再测OD计算浓度和纯度，其余样品放-20℃保存备用。

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