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维容氏支原体探针法荧光RT-LAMP试剂盒

发布时间：2025/9/25 18:02:48 阅读次数：16

CAT#:JW-20-31300
低温运输，-20℃保存

维容氏支原体探针法荧光RT-LAMP试剂盒

产品及特点
维容氏支原体(Mycoplasma wenyonii)是引起牛嗜血支原体病的主要病之一，多引起牛贫血、黄疸、发热和消瘦等症状，对养牛业造成一定的危害，因此快速检测维容氏支原体具有重要的意义。为此，本公司开发了本检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供病毒RNA样品。
2.恒温扩增，可以不需要贵重的荧光PCR等贵重仪器。
3.含探针，可以进一步提高专一性。
4.检测灵敏性可以达到100拷贝/反应左右。
5.特异性高，扩增引物和检测探针均根据维容氏支原体RNA保守序列设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
6.一般30分钟内出结果，比RT-PCR快。
7.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
8.提供内参，便于识别假阴性。
9.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
10.上样量大，对20 μL的反应体系，最大样品加样量高达到13μL。
11.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
12.本产品足够50次20 μL体系的探针法荧光RT-LAMP扩增。
13.只可用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成份                                              编号       规格         包装
RT-LAMP MasterMix
（探针法，待加酶）                   211224a        200 μL    0.5 mL本色盖
逆转录酶-扩增酶混合液              211208b        100 μL    0.5 mL红盖管
20×维容氏支原体RT-LAMP
引物探针混合液干粉
（含内参引物）                            yw20-31300    50次   0.5 mL白盖管
维容氏支原体RT-LAMP
阳性对照（1E4拷贝/mL）            pc31300          50 mL    0.5 mL黄盖管
RT-LAMP通用外源内参
（1E4拷贝/mL）                          ic31300      50 mL    0.5 mL绿盖管
使用手册                                    20-31300sc      1份                无
注意：首次使用本产品的时候，需要在引物探针混合液干粉（含内参引物）管中加入60 mL的自备超纯水，涡旋震荡后短暂离心的到引物探针混合液。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
待测样品。

使用方法
一、样品RNA的制备
1.用自选方法纯化样品RNA，本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10 μL本试剂盒提供的阳性对照（1E4拷贝/μL）加一定量的水使得其总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的起始样品体积一样，NC用水替代。
3.N+2个样品的每个样品在纯化前，每个都要加入10 mL本试剂盒提供的RT-LAMP通用外源内参（1E4拷贝/μL），相当于每个样品在进行核酸纯化前，含有1E5个拷贝的内参分子。
二、探针法荧光RT-LAMP反应（20 μL体系）
4.注意：第一次使用一个新的试剂盒时，必须先将100 mL逆转录酶-扩增酶混合液全部加入到RT-LAMP MasterMix（探针法，待加酶）中，轻柔吹打半分钟混匀，盖上盖子后再轻柔颠倒1分钟混匀，然后取用。
5.反应设置：如果有N+2个RNA纯化样品，则最好设置N+5个RT-LAMP扩增，增加一个阴性对照、一个内参扩增对照和一个阳性对照。在N+5个PCR管中加入下列成分：
成分                             N+2个样品管    扩增阴性对照    扩增阳性对照    扩增内参对照
RT-LAMP MasterMix
（探针法，已加酶）            各6 μL        6 μL                  6 μL                  6 μL
20×维容氏支原体
RT-LAMP引物探针混合液    各1 μL   1 μL                1 μL                1 μL
N+2个样品RNA         各13 μL   -              -
超纯水                       -                13 μL   -
维容氏支原体RT-LAMP
阳性对照（1E4拷贝/μL）                                        13 μL
RT-LAMP通用外源内参
（1E4拷贝/μL）                    -        -            13 μL
6.本产品含两种探针，故在设置荧光PCR仪时，设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集FAM和Cy5两个通道的荧光信号。FAM是样本探针的荧光标记，Cy5是内参探针的荧光标记，淬灭基团均是TAMRA。

三、结果分析
7.判断实验有效性：扩增阴性对照必须没有FAM信号的扩增（扩增是指Ct在40以内，荧光信号呈现标准的S型扩增曲线。任何一个不满足此两个条件，均判读为无扩增。下同），扩增阳性对照必须有FAM信号的扩增，否则整个实验无效，需要分析原因。扩增阴性对照如果有扩增，表示实验试剂或环境有模板DNA的污染。扩增阳性对照没有FAM信号的扩增表示试剂盒或扩增设备或操作有问题，需要分别排查。找到原因并解决问题后方可重启实验。
8.如果实验有效，则可以分析N+2个样品的情况。
情况1、FAM信号有扩增，则此样品应判为阳性，不论Cy5信号有无扩增。
情况2、样FAM信号无扩增，但Cy5信号有扩增，则此样品应判为阴性；
情况3、FAM信号和Cy5信号均无扩增，此样品应判为假阴性（可能原因之一是此样品中有抑制物，也可能核酸在纯化过程中丢失）。此样品需要稀释不同倍数后再测或/和重新进行核酸制备。

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