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除gDNA RT试剂盒

发布时间：2025/9/28 10:14:21 阅读次数：7

CAT#:JW-220606-50
低温运输，-20℃保存

除gDNA RT试剂盒

产品及特点
基因组DNA（gDNA）污染是RNA样品中普遍存在的现象。由于污染的gDNA也会作为后续PCR的模板，因此会严重干扰后续RT-PCR的效率和准确性，尤其是定量RT-PCR。目前的去gDNA污染的方法主要是用RNase-free DNase法降解RNA样品中的gDNA，灭活DNase后，然后再进行RT反应。此方法分两步进行，十分不便。为了克服上述方法的缺点，本公司开发出了本产品，它具有下列特点：
1.一管式去除gDNA，跟RT-PCR反应的设置同步进行。
2.高效，可以使样品中残留的gDNA污染（ng级）降低到PCR检测不到的水平。
3.跟PCR和荧光定量PCR兼容，包括基于古细菌DNA聚合酶的PCR（如Pfu DNA聚合酶，多为高保真酶）。
4.本试剂盒所用的MMLV逆转录酶为RNase H缺失突变，故合成cDNA片段长度可达12 kb。还能用于GC含量高，二级结构复杂的RNA模板。
5.本产品规格足够50次20uL体系的RT反应。
6.本产品只用于科研。

规格及成分
成份                                               编号           规格       包装
5×RT Buffer                              170403a    200uL    0.5mL绿盖管
抗污染MMLV逆转录酶              170403b    100uL    0.5mL红盖管
Oligo (dT)18引物(0.5 ug/uL)    100814       50 uL    0.5mL白盖管
随机引物(0.2 ug/uL)                    100409   50 uL    0.5mL黄盖管
10mM dNTP                                11-220864    20 uL    0.5mL蓝盖管
使用手册                                  190501sc     1份         无
本产品使用五孔盒包装

运输及保存
低温运输，-20℃保存, 有效期一年。

自备试剂
RNA模板。

使用方法
1.在一个干净的无RNase反应管管中加入RNA模板，不超过12uL。
RNA模板种类               加入量
总RNA                    100-500 ng
或poly(A) mRNA    10-500 ng
或专一的RNA 0.01 pg-500 ng
2.加入4 uL 4×RT Buffer。
3.再加入2 uL抗污染MMLV逆转录酶。常温放置30分钟去除gDNA。
4.按下表加入引物：
引物种类                       加入量
Oligo (dT)18(0.5 ug/uL)    1 uL
或随机引物(0.2 ug/uL)      1 uL
或RNA模板专一性引物    1 uL（20 pmol）
注意：随机引物与RNA模板的比例跟cDNA合成的平均长度成反比。
5.加入1uL 10mM each的dNTP。加入引物和dNTP后必须马上进入后续操作，不要放置。
6.最后补水使得总体积为20uL。
7.37℃保温5分钟。对富含二级结构的高GC RNA 模板，可以改成45℃保温5分钟。但如果使用随机引物，由于其很短，则改成25℃ 5分钟以便其跟RNA结合。
8.42℃保温60分钟。但如果使用随机引物，需要先25℃保温10分钟，待合成了一段cDNA后，然后再转移到42℃保温60分钟。此步为RT反应。
9.70℃保温10分钟以终止反应，然后放置在冰上待用。合成的cDNA可以直接作为PCR模板使用，不需要纯化。
10.轻轻吹打混匀，短暂离心，37℃保温60分钟进行抗污染逆转录。
11.95℃10分钟加热灭活相关酶，短暂离心，直接作为模板用于后续常规PCR、染料法qPCR或探针法qPCR实验，或者长期放-20℃待用。用于后续PCR时，一般使用量不超过终体积的1/10，具体需要根据各厂家的PCR试剂盒确定。

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