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革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化试剂盒（过柱法）

发布时间：2025/9/30 15:25:10 阅读次数：11

CAT#:JW-220865
常温运输和保存，有低温成分

革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化试剂盒（过柱法）

产品及特点
本试剂盒用于从革兰氏阳性（G+）细菌中小量制备质粒DNA。本产品是经过精心改良后的碱变性法质粒DNA纯化试剂盒，其原理是菌体经溶菌酶破壁，将破壁后的菌体用碱使基因组DNA和质粒DNA全部变性，经酸中和后的质粒DNA可以快速复性，基因组DNA不能快速复性，通过离心可有效去除基因组DNA。除去基因组DNA后的含质粒DNA的上清用离心吸附柱吸附质粒DNA，洗去杂质，即可得到纯化的质粒DNA。本产品具有如下特点：
1.简单快捷，整个实验在40分钟左右完成。
2.不需要预平衡离心吸附柱。
3.通用洗柱液即开即用，不需要用户额外加乙醇。
4.溶液B中有蓝色染料，便于目测非常关键的碱变性和中和反应两步的溶液混匀状况，保证实验效果。
5.产量高，一次可以处理1-4mL过夜培养的G+菌液，每毫升过夜培养的G+细菌可以提取到2-5μg/mL，纯化后质粒DNA的浓度取决于质粒的拷贝数。
6.纯度高，采用本试剂盒提取的质粒OD比值在1.8-2.0之间，可以直接用于酶切、转化、测序及PCR等。
7.本产品足够50次微量提取。
8.本产品只可用于科研。

规格及成分
本产品使用大扁盒包装
成分            编号    规格    包装
革兰氏阳性细菌质粒DNA
纯化溶液A            220865a    13 mL    15 mL本色瓶
革兰氏阳性细菌质粒DNA
纯化溶液B            220865b    13 mL    15 mL棕色瓶
革兰氏阳性细菌质粒DNA
纯化溶液C            220865c    18 mL    30 mL本色瓶
溶菌酶干粉（20KU/mg）    210808c    250 mg    2.0 mL黄盖管
RNase A溶液，10mg/mL    220714    0.6 mL    2.0 mL本盖管
通用洗柱液        220143    50 mL    60 mL本色瓶
DNA洗脱液
（基因组DNA专用）        220125    10 mL    10 mL本色瓶
离心吸附柱        220144    50套    塑料袋
使用手册            220865sc    1份    无

运输及保存
常温运输和保存，RNase A溶液需要-20℃保存，有效期一年。

自备物品
1.5 mL塑料离心管。

使用方法
1.从筛选平板上挑取单菌落至含抗生素的培养基中，37℃震荡培养12-16小时（摇床转速200-300）。注意：建议使用LB培养基，营养更丰富的培养基会使菌体浓度过高，超过纯化系统的处理能力而降低质粒DNA的质量。另外，延长培养时间会因细胞死亡、裂解而造成质粒DNA浓度降低。
2.用1.5mL离心管收集1-4mL过夜培养饱和菌液，室温12,000rpm离心1分钟，弃上清，再短暂离心，吸弃残留液体。
3.第一次使用本试剂盒时，先将本试剂盒提供的全部RNase A溶液加入到革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液A（简称溶液A，下同）中，摇匀后再取用，未用完的溶液A放4℃保存。
4.加入250μL溶液A到第2步得到的细菌沉淀中，用枪头充分吹打使菌体重悬。注意：细胞未充分悬浮会影响后续碱变性，可以使用漩涡振荡器混匀或使用枪头吸头吹打沉淀至完全混匀。
5.加入大约5mg溶菌酶干粉到细菌悬液中（用0.1mg精度的分析天平称量），轻柔颠倒混匀后室温放置10分钟破裂细胞壁。
6.加入250μL革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液B（下面简称溶液B，如果溶液B在低温放置产生沉淀，须37℃加热溶解后冷却到室温方可使用），温和颠倒4-6次混匀，蓝色将变得均匀并且溶液将变得粘稠。注意：千万不要剧烈振荡，否则基因组DNA断裂产生的片段非常容易污染质粒DNA。溶液B用后需要将盖拧紧存放，否则空气中的二氧化碳会进入溶液，形成碳酸，中和溶液B中的碱，降低其效率。如果溶液B颜色不是蓝色，则表示变质，应该弃之不用并且跟厂家联系。
7.冰上放置不超过5分钟。注意：冰上放置不要超过5分钟，否则质粒DNA会有碱损伤。
8.加入350μL冰上预冷的革兰氏阳性细菌质粒DNA纯化溶液C（下面简称溶液C），温和反复颠倒4-6次，溶液将变成无色，将有白色絮状沉淀产生。
9.冰上放置至少5分钟让质粒DNA复性。不能短于5分钟，一般10分钟。
10.12,000rpm离心3分钟，小心将上清液转移到离心吸附柱中。由于此时的溶液比重较大，部分絮状物悬浮在上清液中属正常现象，吸取上清时避开这些悬浮物即可。如果此步的离心在4℃进行，可减轻沉淀物漂浮。
11.静置2分钟以让质粒DNA与离心吸附柱充分结合。
12.室温12,000rpm离心1分钟，弃收集管中的废液。
13.加入500μL的通用洗柱液到离心吸附柱中，室温12,000rpm离心1分钟，弃收集管中废液。注意：通用洗柱液中含乙醇，每次用后需要将盖拧紧存放，否则乙醇会挥发。
14.重复上步1次。
15.室温12,000rpm离心1分钟，甩干残留液体。此步不能省略，否则残留乙醇会影响DNA的后续使用（如残留乙醇使DNA溶液在电泳上样时不能沉淀到加样孔中）。
16.将离心吸附柱置于一个新的1.5mL塑料离心管中，加入30-100μL 65-80℃预热的DNA洗脱液（基因组DNA专用），室温放置2分钟。
17.室温12,000rpm离心1分钟，离心管底溶液即质粒DNA溶液。

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