关于商城

商城指南

支付方式

配送方式

售后服务

动物线粒体DNA纯化试剂盒（测序级）

发布时间：2025/10/17 12:52:52 阅读次数：3

CAT#:JW-221108-15
常温运输和保存，有三个低温成分

动物线粒体DNA纯化试剂盒（测序级）

产品及特点
线粒体是非常重要的细胞器，它不但跟很多人类疾病相关，而且还是母系遗传研究的重要材料。对线粒体进行遗传研究和进化研究都需要纯化线粒体DNA。本产品先纯化动物细胞线粒体、再从中纯化其DNA。它具有下列特点：
1.即开即用，用户不需要自己配制各种溶液，优化各种条件。
2.两步法，先纯化线粒体，再柱式法纯化其中的DNA，基因组DNA污染少。
3.本产品可以用15次，一次可以处理约1×10E8个培养细胞（相当于5瓶150mm培养细胞），可以纯化到到0.2-0.5mg线粒体。
4.适用于各种动物悬浮培养细胞和贴壁培养细胞，不建议用于动物实体组织。
5.提供线粒体染液，可以在操作中随时监测纯化过程中线粒体的完整性。
6.本产品足够15次动物线粒体DNA纯化。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品第一部分编号为221108pt1，采用大扁盒包装，常温运输和保存
成分                                    编号    规格    包装
动物线粒体提取溶液A        221108a    50mL    60mL本色瓶
动物线粒体提取溶液B        221108b    250mL×2    250mL本色瓶
蔗糖                                  221108c    100g    125mL本色瓶
詹纳斯绿B染色液（0.2%）    211252    1mL    2mL棕色管
细胞器DNA纯化溶液A        211254a    15mL    15mL本色瓶
细胞器DNA纯化溶液B        211254b    7.5mL    10mL本色瓶
细胞器DNA纯化溶液C        211254c    30mL    30mL本色瓶
通用洗柱液                     220143    15mL    15mL本色瓶
DNA洗脱液（基因组DNA专用）    220150    10mL    10mL本色瓶
离心吸附柱                              220144    15套    塑料袋
使用手册                                  221108sc    1份    无

成分                                   编号       规格    包装
DNase A干粉                    211249a    5mg    0.5mL黄盖管
10×DNase A反应液        6-0893b      0.5mL    0.5mL本色盖
Benzonase（1U/μL）    220969      100μL    0.5mL红盖管

本产品第二部分编号为221108pt2，采用塑料袋包装，低温运输，-20℃保存
运输及保存
第一部分常温运输和保存，第二部分低温运输，-20℃保存。保存期均一年。

自备试剂
PBS缓冲液、氯仿、0.5M EDTA溶液（pH8.0）。人细胞核专一性TPMTVNTR上游引物5 GCT CCG CCC TGC CCA TTT 3，下游引物5 GCC TCC GCC ACC AAT GAC 3，人线粒体专一性HV2区上游引物5 GGT CTA TCA CCC TAT TAA CCA C3，下游引物5 CTG TTA AAA GTG CAT ACC GCC A3。

使用方法
注意：线粒体膜对温度高度敏感，故必须在冰上或冷室操作，溶液和离心管都需预冷。
一：准备工作
8.将50mL动物线粒体提取溶液A和250mL动物线粒体提取溶液B放冰上预冷待用。
9.配制1.0M低比重溶液100mL：将34克蔗糖用100mL动物线粒体提取溶液B溶解并放冰上待用。
10.配制线粒体重悬液100mL：将75mL动物线粒体提取溶液B和25mL 1.0M低比重溶液混合，放冰上待用。
11.未用完的1.0M低比重溶液和线粒体重悬液需要-20℃保存，否则容易长菌。下次使用前需充分溶解沉淀并摇匀。
二：线粒体粗提
12.如果提取材料是单层培养细胞，先用20mL自备的PBS缓冲液洗涤1×10E8个培养的单层细胞，共洗涤2次。然后用塑料刮匙刮下细胞，重悬在20mL PBS缓冲液中。如果是悬浮细胞，则4℃1000g离心10分钟收集1×10E8个细胞，再用20mL PBS缓冲液洗涤2次，最后将细胞重悬在20mL PBS缓冲液中。
13.用平甩转子（swinging-bucket rotor）离心机1000g 4℃离心10分钟，弃上清留沉淀。
14.加入5倍体积(以细胞沉淀的体积为基数)的预冷的动物线粒体提取溶液A，轻柔重悬细胞。
15.冰上放置4-5分钟。注意：冰浴时间不要超过5分钟。
16.如果是成纤维细胞，由于其难以裂解，可将细胞重悬液在-80℃放置20-30分钟后再化冻，然后进入下步操作。如果不是成纤维细胞，则直接进入下步操作。
17.将细胞重悬液体转移到预冷的Dounce玻璃匀浆器中（工作体积为10-15mL，间隙为0.12mm，最好是玻璃材质，否则线粒体产率会降低）匀浆适当次数。细胞株不同，其最适匀浆次数不同，一般需要40次-60次左右。匀浆是线粒体纯化最关键的步骤，故匀浆前最好先通过预实验确定最适匀浆次数，方法是每匀浆5-10次后，取2-3μL匀浆液到载玻片上，然后在相差显微镜下观察，完整细胞数量降低到20%以下为佳。
18.加入1/3体积的、预冷的1.0M低比重溶液，轻柔混匀。
19.用平甩转子离心机4℃1000g离心10分钟。沉淀含残留完整细胞、细胞碎片和细胞核，上清液含线粒体。
20.转移上清液到离心管中，冰上放置。在显微镜下检测上清液中线粒体的完整性。具体做法是先滴50μL左右上清液到载玻片上，再滴入50μL詹纳斯染液绿B染色液20分钟，油镜下观察，蓝绿色颗粒状物即为线粒体。
21.用固定角度转子（fixed-angle rotor）离心机4℃15,000g离心15分钟，弃上清，所得棕黑色沉淀即为粗提线粒体沉淀。
22.用5mL线粒体重悬液重悬线粒体，4℃15,000g离心15分钟，弃上清。
23.重复上步一次。
24.如果后续实验是提取mtDNA用于PCR或Southern杂交，则直接进入第四部分mtDNA提取，也可以放-80℃长期保存待用。如果后续实验是提取mtDNA用于高通量测序，则必须彻底降解掉其中的细胞核DNA污染。匀浆过程中一个破裂的细胞核释放出的DNA相当于上百万个线粒体的DNA量之合，所以无论如何小心，粗提线粒体中必有大量的细胞核DNA污染，如果不将其清除，高通量测得的序列将绝大部分来于核DNA而非mtDNA。
三：细胞核DNA的去除及鉴定
25.将线粒体重悬于0.3mL预冷的线粒体重悬液中，取10μL作为未处理线粒体（后面将使用）。
26.加入6μL Benzonase（1U/μL）溶液和30μL DNase A溶液（配法：将0.5mL 10×DNase A反应液加到装有5mg DNase A干粉的离心管中得到10mg/mL DNase A溶液，未用完的此溶液需要分装后放-20℃保存）。
27.37℃保温一段时间酶切细胞核DNA。注意：最好先预实验，每隔一段时间取10μL样品，灭活其中的DNase后作为模板用PCR扩增人基因组TPMT VNTR位点和人mtDNA HV2区(两基因的PCR引物见自备试剂)，检测不到VNTR基因而能检测到mtDNA基因的处理时间为最佳。相关引物和PCR试剂需要自备。可用未处理线粒体作为对照。
28.加入10μL自备的0.5M EDTA溶液（pH8.0）以终止酶反应。詹纳斯绿B染色并在显微镜下检查线粒体完整性（操作见上）。
29.4℃10,000g离心10分钟，弃上清。
30.用1mL的预冷线粒体重悬液重悬线粒体后，4℃10,000g离心10分钟，弃上清留沉淀。
31.重复上步操作，最后得到无基因组DNA污染的线粒体沉淀。
四：线粒体DNA提取
32.在线粒体沉淀中加入600μL预热的细胞器DNA纯化溶液A到线粒体沉淀中，充分吹打均匀。
33.再加入300μL预热的细胞器DNA纯化溶液B到离心管中（此溶液粘稠，需要预热到65℃取用），颠倒数次混匀。此时溶液中可能有白色丝状悬浮物产生。
34.65℃放置5分钟。
35.加入200μL自备氯仿，震荡混匀10-30秒，此时溶液将呈乳白色。如果省略次步，得到的DNA中将有蛋白污染。
36.12,000g室温离心2分钟。此时上清液将变得透明，中间层有白膜。小心转移上清液到一个新的1.5mL塑料离心管中，避免触及中间的白膜。
37.加入1.5倍体积的细胞器DNA纯化溶液C，颠倒混匀后转移到离心吸附柱中，静置2分钟。
38.12,000g室温离心1分钟，弃收集管中的穿透液。
39.将0.5mL通用洗柱液加入离心柱中，12,000g室温离心1分钟，弃穿透液。
40.重复上步操作一次。
41.空甩半分钟去除残留液体，将离心吸附柱转移到新的1.5mL离心管中。
42.加30-50μL DNA洗脱液（基因组DNA专用），室温放置3-5分钟。
43.12,000g室温离心1分钟即得纯化的mtDNA溶液，立即使用或放-20℃长期保存。

关联产品
植物线粒体DNA纯化试剂盒