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2×染料法Tth qRT-PCR MasterMix

发布时间：2025/11/25 15:48:24 阅读次数：6

CAT#:JW-990103-1
低温运输，-20℃保存

2×染料法Tth qRT-PCR MasterMix

产品及特点
本产品是基于Tth DNA聚合酶的荧光染料法RT-PCR MasterMix，它含有经过优化的缓冲液组分、Tth DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、SYBR Green I等所有实时定量RT-PCR所需要的成分。与常用的MMLV-Taq DNA酶RT-PCR体系相比，它们的区别如下：

本产品具有下列特点：
1.方便，用户只需准备模板、引物即可以进行实时定量RT-PCR实验。
2.产品为2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。
3.60-70℃进行RT-PCR，避免了RNA二级结构打不开问题和非特异扩增问题。
4.各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。
5.本规格有1mL，足够100次20uL体系的染料法荧光定量RT-PCR。
6.比进口同类产品性价比更高。
7.本系列产品只可用于科研。
规格及成分
本产品采用塑料袋包装
成分                                                    编号        规格       包装
2×染料法Tth qRT-PCR MasterMix    990103    1 mL    1.5mL棕色管
使用手册                                        990103sc    1份        无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂
RNA模板、引物、超纯水。
使用方法
1.按下表设置染料法Tth RT-PCR反应，以一个样本为例：
成分                                                   样品管    阴性对照    阳性对照
2×染料法Tth qRT-PCR MasterMix    10 μL       10 μL      10 μL
自备引物1（10μM）                          1μL        1μL           1μL
自备引物2（10μM）                           1μL      1μL      1μL
自备模板RNA（100ng-1μg）          1-2μL
阳性对照RNA模板（100ng-1μg）              1-2μL
补超纯水到                                         20μL         20μL        20μL

2.放入荧光PCR仪中进行扩增，下表的扩增参数仅供参考，一般需要根据靶分子长度，引物的Tm值等进行调节。一般选择三步法PCR：
步骤                                温度   时间
逆转录（RT步骤）    60-70℃    30 min（具体温度根据引物Tm决定）
预变性                           95℃    3 min
PCR（35-45次循环）     95℃    15 sec
                                  55-65℃    15-30 sec
                                       72℃    30 sec（采集SYBR通道的荧光信号）
溶解曲线分析    按PCR厂家建议进行
如果引物Tm值接近60℃，也可以选择两步法PCR：
步骤                                温度    时间
逆转录（RT步骤）    60-70℃    30 min（具体温度根据引物Tm决定）
预变性                            95℃    3 min
PCR（35-45次循环）    95℃    15 sec
                                       60℃    60 sec（采集SYBR通道的荧光信号）
溶解曲线分析    按PCR厂家建议进行

3.定量分析数据处理：根据溶解曲线分析剔除假阳性样本。如果样本经过溶解曲线分析，其数据有效，则进行定量分析。以6个10倍稀释的标准曲线样本的浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
4.定性分析数据处理：根据溶解曲线分析剔除假阳性样本。如果样本经过溶解曲线分析，其数据有效，则进行定型分析。阴性对照Ct大于或等于40（此处为便于叙述姑且以40为例，具体设置成多少需要用户根据引物探针的具体情况测试确定）。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于40。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于40则为阳性。

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