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人ApoE基因c.388 T>C（p.C130R）点突变探针法qPCR检测试剂盒

发布时间：2025/11/26 9:04:23 阅读次数：4

CAT#:JW-15-rs429358
低温运输，-20℃保存

人ApoE基因c.388 T>C(p.C130R)点突变探针法qPCR检测试剂盒

产品及特点
人ApoE基因编码载脂蛋白E，位于第19号染色体上，全长3647bp，有4个外显子和3个内含子，编码317个氨基酸。ApoE基因有两个SNPs，分别是rs429358（c.388T>C）和 rs7412（c.526C>T）。它们分别导致ApoE蛋白第112位和第158位氨基酸的改变，从而产生3种常见的ApoE亚型，分别是 E2（388T-526T）、E3（388T-526C）和E4（388C-526C）。ApoE3被认为是野生型，第112位是半胱氨酸，158位是精氨酸。突变型ApoE2的两个位点都是半胱氨酸，突变型ApoE4的两个位点都是精氨酸。它们之间的关系示意图如下：

全基因组关联分析证实，ApoE的E4等位基因是阿尔茨海默病（AD）最强的遗传风险因素。只要携带一个E4等位基因，无论另外一个等位基因是E2还是E3，AD发病率会增加3-4倍。如果携带两个E4等位基因，AD发病率会增加9-15倍。因此快速检测rs429358（c.388T>C）点突变具有重要的意义。为此本公司开发了简单快捷的检测该位点的点突变探针法qPCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/μL。
3.能检测出5%的点突变。
4.提供两种阳性对照，便于区分假阴性样品。
5.特异性高，引物是根据ApoE基因rs429358位点设计，不会跟其他位点的DNA发生交叉反应。
6.本产品只能定性，不能定量。
7.本产品足够50次20μL体系的点突变探针法荧光定量PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                                     编号           规格           包装
2×点突变Probe qPCR MagicMix                          190303        0.5 mL    0.5mL本色盖
超纯水                                                                       210806        1 mL      1.5mL蓝盖管
rs429358位点检测引物-探针干粉         ywpb15- rs429358   50次      0.5mL白盖管
rs429358位点TT阳性对照(1×10E4拷贝/μL)    pc15- rs429358t 250 μL    1.5mL棕色管
rs429358位点CC阳性对照(1×10E4拷贝/μL)    pc15- rs429358c    250 μL    0.5mL黄盖管
使用手册                                                              15-rs429358sc    1份                  无
注意:引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2ug/μL。
2.本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。

三、点突变Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
3.如果只做1次重复，则标记N+3个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板，NC），3个用于阳性对照（分别对应两种纯合子基因型和一种杂合子基因型）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                              样品管N个      NC       TT          TC        CC
2×点突变Probe qPCR MagicMix                   各10 μL        10 μL    10 μL    10 μL    10 μL
rs429358位点检测引物-探针混合液               各4 μL      4 μL      4 μL   4 μL 4 μL
N个DNA样本                                             各3 μL
超纯水                                                            各3 μL    6 μL     3 μL        3 μL
rs429358位点TT阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                                     3 μL      3 μL     不加
rs429358位点CC阳性对照(1×10E4拷贝/μL)               3 μL    3 μL
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                  温度    时间
预变性          95℃    90 sec
PCR反应
（45个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）
五、数据处理
6.一般的荧光定量PCR仪在基因分型的模式下，都可以自动根据两个通道获得的荧光值，计算每个样品的比值（HEX值/FAM值，HEX为突变探针标记，FAM为野生型探针标记），并描出散点图。突变基因型的比值点将位于散点图的Y轴方向，正常基因型的比值将位于X轴方向，杂合子基因型的比值将位于中间，阴性对照的比值将位于原点附近。如果阴性对照有任何信号，则表示污染，本次实验无效，需要寻找原因。散点图的示例如下：

也可以手动整理下表进行基因型判断。首先设置阈值，FAM的阈值根据TT阳性对照的FAM荧光值设置，HEX的阈值根据CC阳性对照的HEX荧光值设置。如果阴性对照有任何信号，则表示污染，本次实验无效，需要寻找原因。如果实验有效，则分析样品。如果样品Ct值低于35，则算有扩增。高于35，则算无扩增。
阳性对照        FAM通道    HEX通道    基因型
CC阳性对照    无扩增   有扩增       纯合突变
TC阳性对照    有扩增       有扩增   杂合突变
TT阳性对照   有扩增       无扩增   正常
阴性对照         无扩增       无扩增           -

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