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粗球孢子菌荧光染料法LAMP试剂盒

发布时间：2025/11/27 11:45:29 阅读次数：9

CAT#:JW-18-62020
低温运输，-20℃保存

粗球孢子菌荧光染料法LAMP试剂盒

产品及特点
粗球孢子菌(Coccidioides immitis) 粗球孢子菌可引起人和动物的原发性皮肤感染,并引起肺、脑膜、脾、骨骼、皮肤、肌肉等病症，发病以青壮年和野外工作者居多。临床表现为急性良性无症状的或自限性的呼吸器官原发性感染；偶尔播散,可在皮肤,皮下组织,淋巴结,骨骼,肝脏,肾脏,脑膜,大脑或其他组织形成局灶性病变。因此对粗球孢子菌的快速准确鉴定有有重要的意义，为此本公司根据荧光染料法LMAP技术，开发了简单快捷的粗球孢子菌LAMP检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供DNA样品。
2.恒温扩增，可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
3.检测灵敏性一般比PCR高10倍以上。
4.特异性高，根据粗球孢子菌DNA保守序列设计4条特异引物，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.一般30分钟内出结果，比PCR快。
6.上样量大，对20 μL的反应体系，最大样品加样量高达到14 μL。
7.内含的dUTP-UNG可防交叉污染。
8.提供无传染性的阳性对照，便于分析实验结果。
9.本产品只能用于定性分析，不推荐用于定量分析。
10.本产品足够50次20 μL体系的荧光LAMP扩增。
11.只可用于科研。

规格及成分
本产品采购5孔盒包装
成份                                                                        编号        规格            包装
4×LAMP MasterMix （荧光染料法，待加酶）    211222a   200μL    0.5mL绿盖管
Bst DNA聚合酶2.0                                            11-220319      50μL     0.5mL红盖管
20×粗球孢子菌LAMP引物混合液干粉               yw16-56210    50次    0.5mL白盖管
粗球孢子菌LAMP阳性对照（1×10E4拷贝/μL）    pc56210 250μL    0.5mL黄盖管
超纯水                                                                    210806      1 mL      1.5mL蓝盖管
使用手册                                                            18-56210sc    1份           无
注意：首次使用本试剂盒时，需要加入55μL超纯水到引物干粉管中，涡旋震荡半分钟混匀，得到20×引物混合液。短暂离心后即可使用。未用完的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
待测样品，荧光定量PCR仪。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10μL本试剂盒提供的阳性对照（1×10E4拷贝/μL）加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

二、LAMP反应（20μL体系）
1.反应设置：第一次使用时请把所有Bst DNA聚合酶2.0（50μL，本试剂盒提供）加入到 4×LAMP MasterMix（荧光染料法，待加酶）中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增，增加LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
成分                                            N+2个样品管    LAMP阴性对照    LAMP阳性对照
4×荧光LAMP MagicMix（加酶后）    各5 μL           5 μL                     5 μL
20×粗球孢子菌LAMP引物混合液       各1 μL           1 μL                       1 μL
N+2个样品DNA                                  各14 μL           -                                -
超纯水                                                   -               14 μL                         -
第2步所得阳性对照的10倍稀释液          -                 -                             14μL
2.放荧光定量PCR仪上扩增，设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

三、结果分析
1.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10μL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带（200bp左右的梯形扩增产物），LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

2.荧光分析（仅限于用qPCR仪进行反应的场景）：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。

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