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猴痘病毒探针法qPCR试剂盒（含内参）

发布时间：2025/11/27 14:39:52 阅读次数：4

CAT#:JW-17-13600
低温运输，-20℃保存

猴痘病毒探针法qPCR试剂盒（含内参）

产品及特点
猴痘病毒（Monkeypox Virus）属正痘病毒属，可在非洲绿猴肾细胞中培养生长，导致细胞病变。人类感染猴痘，主要通过被已感染的动物咬伤，或直接接触被感染动物的血液、体液、猴痘病损而受染；通常由动物传给人，偶也可以发生人到人的猴痘传播。一般认为是在直接的、长时间面对面的接触中，通过含毒的大量呼吸飞沫而传播。猴痘还可以通过直接接触感染者的体液或病毒污染的物品（如衣服和被褥）而传播。主要临床症状为发热、剧烈头痛、淋巴结肿大、背痛、肌肉痛（肌肉疼痛）以及倍感无力（精神不振）。因此快速检测猴痘病毒具有重要的意义。
本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门检测猴痘病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/μL。
3.提供阳性对照和内参，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物是根据猴痘病毒高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成分                                                                        编号              规格            包装材料
2×Probe PCR Magic Mix                                     190303        0.5 mL    0.5mL本色管
荧光PCR专用模板稀释液                                   180701           1 mL   1.5 mL绿盖管
猴痘病毒PCR引物-探针混合液（含内参探针）    yp17-13600      50 次      0.5mL棕色管
猴痘病毒PCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)          Pc17-13600      50 μL      0.5mL黄盖管
猴痘病毒PCR内参(1×10E4拷贝/μL)               Icpd17-13600    250 μL    0.5mL白盖管
使用手册                                                                17-13600sc      1份               无
注：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入200mL超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备物品
样品DNA。

使用方法
一、稀释含内参的标准曲线样品（以阳性对照10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度和内参固定在10E3拷贝/μL为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1，0。
2.在0号管中加入280μL荧光PCR专用模板稀释液，35μL本试剂盒提供的内参，震荡一分钟混匀。
3.用带芯枪头分别将上步得到的混合液按45μL/管加入到标记的1-6号管中，最好用带芯枪头（下同）。
4.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
7.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线阳性样品，每个样品中内参的浓度固定为10E3拷贝/μL。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
8.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟每次制备要求的体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。最后在所有样本中加入5uL 本试剂盒提供的内参（共50000拷贝）。
9.用自选方法纯化样品的DNA（含内参），本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分                                                        样品管N+2个    PCR阴性对照    标准曲线样品管（1-6管）
2×Probe qPCR MagicMix                                 各10 μL      10 μL               各10 μL
猴痘病毒PCR引物-探针混合液(含内参引物)   各4 μL           4 μL              各4 μL
N+2个待测DNA（含内参）                               各6 μL           不加                不加
超纯水                                                              不加             6 μL               不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（含内参，1-6号）    不加    不加    各6μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                  温度    时间
预变性                95℃    3 min
PCR反应
（45个循环）    95℃    10 sec
                          60℃   60 sec
                          72℃    60 sec（采集FAM通道和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

四、数据处理
13.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。对任何阴性样品，如果内参无Ct，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。
14.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照（FAM通道）和内参（HEX通道）的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95，内参的标准曲线为一条跟X轴平行的横线。再以待测样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
15.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。对任何FAM通道结果为阴性的样品，如果其对应的内参HEX通道无Ct，则此样品的阴性结果无效，此样品需要重复实验。

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