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高等植物内源tRNALeu基因荧光及可视化LAMP试剂盒

发布时间：2025/12/1 11:52:21 阅读次数：4

CAT#:JW-16-GMO0002
低温运输，-20℃保存

高等植物内源tRNALeu基因荧光及可视化LAMP试剂盒

产品及特点
在对高等植物进行GMO基因检测的时候，往往需要同时对高等植物的一个内源基因进行检测，此内源基因就相当于内源性内参，如果靶基因检测结果为阳性时，内源基因的检测结果是阴是阳均不影响对靶基因的结果判断。但当靶基因检测结果为阴性时，内源基因的结果就是判断靶基因是真阴性还是假阴性的关键。如果一个样本靶基因是阴性，内源基因也是阴性，则可能是由于扩增抑制物等因素导致的阴性，不能排除靶基因是假阴性，因此本样本需要重测。如果一个样本靶基因是阴性，内源基因是阳性，则说明扩增有效，靶基因是真阴性。因为在对高等植物进行GMO基因检测的同时，同时对其内源基因进行相同的检测具有重要的意义。为此本公司根据双染料LMAP技术，开发了高等植物内源tRNALeu基因检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供DNA样品。
2.含可见光和荧光染料，既可以用金属浴和水浴扩增用可见光肉眼判断结果，也可用荧光PCR仪进行实时荧光检测。
3.检测灵敏性一般比PCR高10倍以上。
4.特异性高，根据高等植物内源tRNALeu基因保守序列设计特异引物，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.上样量大，对20mL的反应体系，最大样品加样量高达到14mL。
6.提供阳性对照，便于分析实验结果。
7.一般跟GMO靶分子结合使用，用于判断靶分子的阴性检测结果是真阳性还是假阳性，不能用于定量分析。
8.本产品足够50次20mL体系的荧光及可视化LAMP扩增。
9.本产品只可用于科研。

规格及成分
本产品采购五孔盒包装
成分                                                                                                    编号          规格            包装
4×LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料双染料法，待加酶）    211223          200mL    0.5mL绿盖管
Bst DNA聚合酶2.0                                                                         11-220319        50mL    0.5mL红盖管
20×高等植物内源tRNALeu基因LAMP引物混合液干粉         yw16-GMO0002   50次       0.5mL白盖管
高等植物内源tRNALeu基因LAMP阳性对照（1×10E4拷贝/mL）pcGMO0002      250mL    0.5mL黄盖管
超纯水                                                                                           210806           1 mL    1.5mL蓝盖管
使用手册                                                                                  16-GMO0002sc    1份           无
注意：首次使用本试剂盒时，需要加入55mL超纯水到引物干粉管中，涡旋震荡半分钟混匀，得到20×引物混合液。短暂离心后即可使用。未用完的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为一年。

自备试剂
待测样品。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.用自选方法纯化样品DNA，本试剂盒跟市场上大多数DNA提取试剂盒兼容，包括本公司的免提取的核酸释放剂。
2.如果有N个样品，则需要做N+2个样品制备，包括一个样品制备阳性对照（PC）和一个样品制备阴性对照（NC）。PC用10mL本试剂盒提供的阳性对照（1×10E4拷贝/mL）加一定量的水作为样品制备PC，加水后的总体积跟所用核酸纯化试剂盒所要求的起始样本体积一致。NC用水替代。

二、LAMP反应（20mL体系）
3.反应设置：第一次使用时请把所有Bst DNA聚合酶2.0（50mL，本试剂盒提供）加入到4×LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料双染料法，待加酶）中，轻柔颠倒20次充分混匀，然后再取用。如果有N+2个DNA纯化样品，则最好设置N+4个LAMP扩增，增加LAMP扩增阳性对照和LAMP扩增阴性对照各1个。在N+4个PCR管中加入下列成分：
成分                                                                                            N+2个样品管    LAMP阴性对照    LAMP阳性对照
4×LAMP MasterMix（可视化染料-荧光染料双染料法，已加酶）    各5 mL           5 mL                       5 mL
20×高等植物内源tRNALeu基因LAMP引物混合液                            各1 mL           1 mL                       1 mL
N+2个样品DNA                                                                                各14 mL            -                               -
超纯水                                                                                                    -                14 mL                         -
本试剂盒提供的阳性对照                                                                        -               -                                14mL
4.如果使用金属浴或水浴保温，没有热盖，则每个反应管中加入50mL自备的PCR级石蜡油，否则保温期间反应体系的水分会蒸发到管盖下方凝集，反应体积变化，会严重影响反应效率，增加假阳性率。最后置于65℃保温60分钟进行扩增。
5.如果使用常规PCR仪进行LAMP反应，设置程序时必须打开热盖，设置成65℃保温60分钟进行扩增。
6.如果使用荧光定量PCR仪，则设置60次循环，每次65℃保温1分钟，采集SYBR通道的荧光信号。

三、结果分析
7.电泳分析：由于取样时非常容易产生气溶胶污染，污染实验环境并且非常难清除污染，所以强烈建议不要采取此方法分析实验结果。即使使用，也要在不同的房间，使用不同的移液枪操作。具体做法是取10mL LAMP扩增产物跟自备上样液混合后进行2%琼脂糖凝胶电泳。LAMP阳性对照必须有正常LAMP条带（200bp左右的梯形扩增产物），LAMP阴性结果必须无条带，否则实验结果无效。如果LAMP阳性对照和阴性对照结果正常，再分析待测样品。典型的电泳结果见下表，奇数样为阴性结果，偶数样为阳性结果：

8.可见光（肉眼）分析：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈蓝色，样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将呈淡蓝色或无色，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的颜色接近扩增阳性对照管则说明样品为阳性，如果接近阴性对照则说明待测样品为阴性。典型的可见光检测结果见下图（9为阴性，10为阳性）。

9.荧光分析（仅限于用qPCR仪进行反应的场景）：样品制备阳性对照和LAMP阳性对照的反应液将有标准的S扩增曲线，样品制备阴性对照和LAMP阴性对照的反应液将没呈平线，没有S曲线，否则提取实验或扩增实验无效。如果阳性和阴性对照结果正常，则实验有效，可以分析样品的情况。样品管的荧光曲线为S型，则说明样品为阳性，如果为平线则说明待测样品为阴性。典型的荧光检测结果见下图。左边为阳性，右边为阴性。

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