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肉毒梭状芽孢杆菌btxE/btxF基因双重探针法qPCR试剂盒

发布时间：2025/12/2 15:21:56 阅读次数：3

CAT#:JW-15-34510-btxE-btxF
低温运输，-20℃保存

肉毒梭状芽孢杆菌btxE/btxF基因双重探针法qPCR试剂盒

产品及特点
肉毒杆菌（Clostridium botulinum）是一种致命病菌，它在繁殖过程中分泌肉毒毒素，该种毒素是已知的最剧毒物，可抑制胆碱能神经末梢释放乙酰胆碱，导致肌肉松弛型麻痹。根据它产生的毒素的不同，肉毒杆菌分为A、B、C、D、E、F、G七个亚型。它们产生的A~G型肉毒毒素具有相同的作用机制，只是识别的特异底物蛋白有所不同。因此对肉毒杆素进行快速检测和分型具有重要的意义。本产品就是以探针法qPCR技术为基础开发的专门对肉毒杆菌E/F型进行检测和分型的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物是根据肉毒杆菌E/F型DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.两个探针分别用FAM和HEX标记，检测和分型同时完成。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
8.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                编号                规格               包装
2×Probe qPCR MasterMix           981201             0.5 mL             0.5mL本色盖
荧光PCR模板专用稀释液           180701          1 mL                1.5mL绿盖管
肉毒杆菌E/F型双重qPCR
引物-探针干粉                        yp15-34510EF       50次                 1.5mL棕色管
肉毒杆菌E型qPCR阳性对照(1×10E7拷贝/μL)    pc15-34510E    50 μL    0.5mL黄盖管
肉毒杆菌F型qPCR内参
(1×10E7拷贝/μL)                    pc15-34510F            50 μL              0.5mL白盖管
使用手册                            15-34510-btxE-btxF sc    1份                无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂
超纯水，样品DNA。

使用方法
一、稀释肉毒杆菌E型检测标准曲线样品（以阳性对照10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分。
1.标记6个离心管，分别为A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2.在A1-A6号管中各加入45μL荧光PCR专用模板稀释液。
3.在A6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线PC样品。放冰上待用。
4.换枪头，在A5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在A4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作得到A1-A6共六个稀释度的标准曲线阳性样品。放冰上待用。

二、稀释肉毒杆菌F型检测标准曲线样品
7.操作同上，只是使用肉毒杆菌F型的PC作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用，分别是B1-B6。

二、样品DNA的制备
8.如果有N个样品，最好设置N+3个提取，多出的一个是肉毒杆菌E型的PC（样品制备阳性对照），一个是肉毒杆菌F型的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL第一步和第二步所得的4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此分别作为两个PC。另外用水作为NC，水的总体积需要跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样。
9.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
10.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+3+1+6+6个PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于肉毒杆菌E型的标准曲线，另外6个用于肉毒杆菌F型的标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+3+3个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于肉毒杆菌E型RT-PCR阳性对照，1个用于肉毒杆菌F型RT-PCR阳性对照（直接用第一步和第二步所得的两个4号稀释液作为模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
11.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                样品管N+2个    PCR阴性对照    标曲样品管（A1-A6）    标曲样品管（B1-B6）
2×Probe qPCR MasterMix                各10 μL            10 μL                    各10 μL                        各10 μL
肉毒杆菌E/F型双重qPCR引物-探针混合液    各4 μL    4 μL                   各4 μL                          各4 μL
N+2个待测DNA样本                       各6 μL                 不加                      不加                         不加
超纯水                                              不加                  6 μL                       不加                            不加
第一步所得标准曲线
样品稀释液（A1-A6号）                不加                不加      各6μL（A2号样到A2号管，A3号样到A3号管…）    不加
第二步所得标准曲线
样品稀释液（B1-B6号）                   不加              不加      不加      各6μL（B 2号样到B 2号管，B 3号样到B 3号管…）
12.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                       温度    时间
预变性                   95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）      95℃    15 sec
                            60℃    60 sec（采集FAM通道和Hex通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）

四、数据处理
13.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
14.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
15.如果把本试剂盒用于定量检测，则以阳性对照浓度的log值为横轴，分别以阳性对照（FAM通道）和（HEX通道）的Ct值为纵轴，绘制标准曲线，阳性对照的标准曲线为斜线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从阳性对照的标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再推算出其浓度。
16.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为肉毒杆菌E型阴性，如果小于或等于35则为肉毒杆菌E型阳性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40则为肉毒杆菌F型阴性，如果小于或等于35则为肉毒杆菌F型阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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