当前位置：首页>技术专栏
发布时间：2025/12/2 15:24:18 阅读次数：2
CAT#:JW-15-60140-60150
低温运输，-20℃保存
MS2病毒-MS3病毒双重探针法qRT-PCR试剂盒
产品及特点
大肠杆菌MS2病毒是二十面体的单链正义RNA病毒，可感染大肠杆菌和肠杆菌科的其他成员。MS2病毒属于轻巧病毒(Levivirus)家族的成员，其中包括病毒f2、病毒Qβ、病毒R17和病毒GA。其基因组含有3569个核苷酸，编码成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白四种蛋白。与其组装相关的蛋白为成熟酶蛋白和衣壳蛋白。今年，MS2病毒常用于构建RNA诊断产品用的阳性质控品。
大肠杆菌MS3病毒是二十面体的单链正义RNA病毒，可感染大肠杆菌和肠杆菌科的其他成员。MS2病毒属于轻巧病毒(Levivirus)家族的成员，其中包括病毒f2、病毒Qβ、病毒R17和病毒GA。其基因组含有3569个核苷酸，编码成熟酶蛋白、衣壳蛋白、复制酶蛋白和裂解蛋白四种蛋白。与其组装相关的蛋白为成熟酶蛋白和衣壳蛋白。今年，MS3病毒常用于构建RNA诊断产品用的阳性质控品。
因此快速检测MS2病毒具有重要意义。本产品就是以探针法qRT-PCR技术为基础开发的专门检测MS2病毒和SM3病毒的试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品RNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到100拷贝/反应。
3.提供阳性对照，便于排除假阴性结果。
4.特异性高，引物和探针分别根据MS2病毒和MS3病毒RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5各数量级。
6.两个探针分别用FAM和HEX标记，检测和分型同时完成。
7.本产品足够50次20μL体系的探针法RT-PCR反应。
8.本产品只能用于科研。
规格及成分
本产品使用十孔盒包装
成分 编号 规格 包装材料
探针法qRT-PCR缓冲液 990504a 500 μL 0.5mL蓝盖管
探针法qRT-PCR酶混合液 990504b 100 μL 0.5mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液 180701 1 mL 1.5 mL绿盖管
MS2病毒-SM3病毒RT-PCR引物-探针干粉（含内参探针） yp17-60140 50次 0.5mL棕色管
MS2病毒阳性对照(1×10E7拷贝/μL) pc15-60140 50 μL 0.5mL黄盖管
MS3病毒阳性对照(1×10E7拷贝/μL) icpc17-60140 250 μL 0.5mL白盖管
使用手册 17-60140sc 1份 无
注意：引物-探针干粉(含内参探针)在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入220uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存
运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。
自备试剂
样品RNA。
使用方法
一、稀释含内参的SM2病毒检测标准曲线样品（以阳性对照10E1-10E6拷贝/μL这6个10倍稀释度和内参固定在10E3拷贝/μL为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1，0。
2.在0号管中加入280μL荧光PCR专用模板稀释液，35μL本试剂盒提供的内参，震荡一分钟混匀。内参的浓度为1111拷贝/μL。
3.用带芯枪头分别将上步得到的混合液按45μL/管加入到标记的1-6号管中，每管中含内参50000拷贝。最好用带芯枪头（下同）。
4.在6号管中加入5 μL 1×10E7拷贝/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10E6拷贝/μL的标准曲线PC样品。放冰上待用。
5.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10E6拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E5拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.换枪头，在4号管中加入5 μL 1×10E5拷贝/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1×10E4拷贝/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
7.重复上面的操作直到得到6个稀释度的标准曲线阳性样品，每个样品中内参的浓度固定为10E3拷贝/μL，总拷贝数为5×10E4。放冰上待用。
二、稀释含内参的SM3病毒检测标准曲线样品
8.操作同上，只是使用SM3病毒的PC作为模板。得到6个浓度的样本放冰上待用。
三、样品RNA的制备
9.如果有N个样品，最好设置N+3个提取，多出的一个是SM2病毒的PC（样品制备阳性对照），多出的一个是SM3病毒的PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL第一步和第二步所得的两个4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样，以此分别作为两个PC。另外用水作为NC，水和内参的总体积需要跟样本制备试剂盒所要求的样本体积一样。
10.用自选方法纯化样品的RNA（含内参），本试剂盒跟市场上大多数RNA提取试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。
三、Probe qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
11.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+3+1+6+6个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于SM2病毒的标准曲线，另外6个用于SM3病毒的标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+3+3个RT-PCR管，其中N+3个用于上步得到的N+3个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于SM2病毒RT-PCR阳性对照，1个用于SM3病毒RT-PCR阳性对照（直接用第一步和第二步所得的两个4号稀释液作为模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
12.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复）：
成分 样品管N+3个 RT-PCR阴性对照 标曲样品管（A1-A6） 标曲样品管（B1-B6）
探针法qRT-PCR缓冲液 各10 μL 10 μL 各10 μL 各10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液 各2 μL 2 μL 各2 μL 各2 μL
MS2病毒-SM3病毒
RT-PCR引物-探针混合液 各4 μL 4 μL 各4 μL 各4 μL
N+3个待测RNA 各4 μL 不加 不加 不加
超纯水 不加 4 μL 不加 不加
第一步所得标准曲线
样品稀释液（A1-A6号） 不加 不加 各4μL（A2号样到A2号管，A3号样到A3号管…） 不加
第二步所得标准曲线
样品稀释液（B1-B6号） 不加 不加 不加 各4μL（B 2号样到B 2号管，B 3号样到B 3号管…）
13.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程 温度 时间
逆转录 50℃ 15 min
预变性 95℃ 10 min
RT-PCR反应
（45个循环） 94℃ 30 sec
60℃ 60 sec（采集FAM通道和Hex通道的荧光信号，淬灭基团均为TAMRA）
四、数据处理
14.如果扩增阳性对照或制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果扩增阴性对照或制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系，购买新的引物和探针。
15.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
16.对定量检测，以标曲样本浓度的log值为横轴，分别以SM2病毒阳性对照（FAM通道）和SM3病毒阳性对照（HEX通道）的Ct值为纵轴，绘制两条标准曲线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从分别从两条标准曲线上推算出对应样品RNA浓度的log值，再推算出其浓度。
17.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为SM2病毒阴性，如果小于或等于35则为SM2病毒阳性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40则为SM3病毒阴性，如果小于或等于35则为SM3病毒阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。
关联产品
MS2病毒荧光及可视化LAMP检测试剂盒
上海极威生物科技有限公司 公司地址:上海市崇明县长兴镇潘园公路1800号2号楼9703室
邮箱：435399850@qq.com 电话：021-80186165 手机：16602115336
备案号：沪ICP备15046135号-4
