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人EGFR基因c.2573T>G（L858R）点突变探针法qPCR检测试剂盒

发布时间：2025/12/3 16:35:36 阅读次数：6

CAT#:JW-15-rs121434568
低温运输，-20℃保存

人EGFR基因c.2573T>G(L858R)点突变探针法qPCR检测试剂盒

产品及特点
EGFR的全名叫表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)，是一种广泛分布于人体各组织细胞膜上的具有酪氨酸激酶的糖蛋白，在许多实体肿瘤中EGFR高表达或异常表达，因此,以EGFR为治疗靶标的分子靶向治疗成为国内外肿瘤界关注的焦点。EGFR基因位于1号染色体上。大约有30%的癌症患者都存在EGFR突变，其中包括90%的胰腺癌，50%的结肠癌和25%的肺癌。携带21外显子氨基酸替换突变L858R的NSCLC患者对酪氨酸激酶抑制剂高度敏感。这种突变是EGFR突变中比较常见的一种，占EGFR突变总数的40%-50%。L858R突变的肺癌患者的预后仍然受到多种因素的影响。一般来说，早期诊断、早期治疗可以提高患者的生存率，因此研究此突变具有重要的研究意义。在DNA水平，EGFR基因的2573T>G突变和2574G>T突变均可导致EGFR蛋白质的L858R突变，但前者更为常见，为此本公司开发了简单快捷的检测2573T>G突变的探针法qPCR检测试剂盒，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到1000拷贝/μL。
3.分辨率高，能检测出5%的点突变。
4.一管式检测，野生型探针用FAM标记，突变型探针用HEX标记。
5.同时提供野生型和突变型两种阳性对照，便于排除假阴性样品。
6.特异性高，引物和探针是根据人EGFR基因rs121434568突变设计，不会跟其他突变发生交叉反应。
7.本产品只能定性，不能定量。
8.本产品足够50次20 μL体系的点突变探针法荧光定量PCR反应。
9.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用五孔盒包装
成分                                                    编号              规格            包装
2×Probe qPCR MasterMix           981201                 0.5 mL    0.5mL本色盖
超纯水                                         210806              1 mL      1.5 mL蓝盖管
rs121434568位点检测
引物-探针干粉                    yp15- rs121434568-lj        50次    1.5 mL棕色管
rs121434568位点野生型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)    pcs59200-001egfr        250 μL    0.5 mL白盖管
rs121434568位点突变型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)    pcs37600-rs1214345    250 μL    0.5 mL黄盖管
使用手册                            15-rs121434568sc           1份    无
注意：使用前需要在引物探针干粉管中加入216 μL的超纯水，震荡混匀后再取用一次没用完剩下的需要放-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、样品DNA的制备
1.如果有N个样品，则进行N次纯化，得到的DNA最后溶解在TE中，并需要用NanoDrop进行定量。最后的浓度不能低于0.2ug/μL。
2.本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。
三、点突变Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
3.如果只做1次重复，则标记N+3个PCR管，其中N个用于上步得到的N样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板，NC），3个用于阳性对照（PC）。
4.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子后最后加）：
成分                                   样品管N个     扩增NC    野生型PC    杂合型PC    突变型PC
2×Probe qPCR MasterMix    各10 μL      10 μL            10 μL           10 μL        10 μL
rs121434568位点检测
引物-探针混合液              各4 μL           4 μL          4 μL         4 μL           4 μL
N个DNA样本             各3 μL
超纯水                           各3 μL            6 μL            3 μL                              3 μL
rs121434568位点野生型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                                          3 μL                                3 μL
rs121434568位点突变型
阳性对照(1×10E4拷贝/μL)                                                             3 μL            3 μL
5.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                 温度    时间
预变性                95℃    5 min
PCR反应
（40个循环）    95℃    15 sec
                          60℃    60 sec（采集FAM和HEX通道的荧光信号，淬灭基团均为MGB）

四、数据处理
6.实验有效性的判断：首先分析扩增NC是否有FAM或/和HEX信号，如果有则表示实验污染，本次实验无效，无需分析所有实验数据，需要寻找原因。如果无则表示实验没有污染，再分析三个PC。如果野生型PC没有FAM扩增信号（有标准的倒S扩增曲线，下同），或突变型PC没有HEX扩增信号，或杂合型PC没有FAM和HEX扩增信号，则表示实验无效，不需要分析样本的数据，需要分析原因。如果三个PC正常（野生型PC有FAM扩增信号，突变型PC有HEX扩增信号，杂合型PC有FAM和HEX扩增信号），则实验有效，可以分析样本的数据。
7.如果荧光定量PCR仪有基因分型的自动分析模块，则进入该模块，获得每个样本的HEX值/FAM值的荧光比值，并根据荧光比值描出散点图。荧光比值位于散点图的X轴方向的样本可以判为突变型，荧光比值将位于Y轴方向的样本可以判为野生型，荧光比值位于X轴和Y轴中间的可以判为杂合子。扩增NC的荧光比值将位于原点附近。散点图的示例如下：

8.如果荧光定量PCR仪没有基因分型的自动分析模块，则需要手动分析。首先根据Ct值判断每个样本在FAM和HEX两个通道的扩增情况。如果FAM通道的Ct低于35，则算FAM信号有扩增。如果Ct大于35或没有Ct，则算FAM通道无扩增。HEX通道也如此操作。然后根据扩增结果按下表判断每个样本的基因型，得到无效数据的样本需要重复：
FAM通道    HEX通道    基因型判断
有扩增        无扩增      野生型
有扩增       有扩增       杂合子
无扩增       有扩增        突变型
无扩增       无扩增        阴性PC或无效数据

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