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人胚肾293细胞基因组DNA残留探针法qPCR试剂盒

发布时间：2026/1/12 14:30:20 阅读次数：4

CAT#:JW-15-169
低温运输，-20℃保存

人胚肾293细胞基因组DNA残留探针法qPCR试剂盒

产品及特点
人胚肾293细胞(Human Embryonic Kidney 293 Cell, HEK293 Cell) 是一种人胚肾细胞系，因其对生长和培养环境要求不高、易于转染，以及相比于常用的CHO细胞翻译后修饰能力更为强大的特点，目前在工业内也被广泛用于抗体蛋白生产、疫苗中的病毒样颗粒生产、细胞和基因治疗中的病毒载体生产等领域。有实验证明，HEK293注入裸鼠中可成瘤，所以HEK293宿主细胞残留成分是生物制品质量控制中一个重要环节，需要被控制在可接受的水平。严格的纯化工艺可以去除一部分宿主细胞DNA（HCD）等残留杂质成分，但产品中仍然可能会有HCD残留，这些残留的外源宿主细胞DNA会引发潜在的安全问题，如潜在致瘤性、传染性，甚至增加免疫源性或导致突变等，所以HCD检测项目是生物制品生产工艺中重要的质量检测指标之一。因此本公司基于荧光定量PCR技术，开发了专门用于检测样品中人胚肾293细胞基因组DNA残留的本产品，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到0.001pg/μL。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物和探针是根据人胚肾293细胞DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品使用五孔盒包装
成分                                                                    编号    规格        包装
2×Probe qPCR MasterMix                               981201       0.5 mL    0.5 mL本色盖
荧光PCR专用模板稀释液                               180701        1 mL    1.5 mL绿色盖
超纯水                                                               210806       1 mL    1.5 mL蓝色盖
人胚肾293细胞qPCR引物-探针混合液干粉        yp15-169    50 次    0.5 mL棕色管
人胚肾293细胞qPCR阳性对照(100pg/μL)     pc15-169    50 μL    0.5 mL黄色盖
使用手册                                                           15-169sc    1份      无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入165mL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以100pg-0.001pg/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5 μL 1×100pg/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10pg/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1pg/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得100ng/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到从100pg/μL 到1ng/μL 共6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的其实样本体积相同。NC可以用水替代。本试剂盒跟市场上大多数核酸纯化试剂盒兼容，也可以选购本公司的免提取核酸释放剂。

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
8.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                        样品管N+2个    RT-PCR阴性对照    标曲样品管（1-6）
2×Probe qPCR MasterMix                            各10 μL               10 μL             各10 μL
人胚肾293细胞qPCR引物-探针混合液          各3 μL             3 μL                各3 μL
N+2个待测DNA样本                                      各7 μL               不加               不加
超纯水                                                           不加                  7 μL                不加
第6步所得标准曲线
样品稀释液（1-6号）                                        不加                  不加               各7μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
10.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程                    温度    时间
预变性               95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）    94℃    20 sec
                           53℃    30 sec(采集FAM通道的荧光信号,设置TAMRA为淬灭基团)
数据处理
11.以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再通过样品DNA浓度的log值推算出其浓度。

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