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大肠杆菌总RNA残留探针法qPCR试剂盒

发布时间：2026/1/12 14:59:18 阅读次数：8

CAT#:JW-15-157R
低温运输，-20℃保存

大肠杆菌总RNA残留探针法qPCR试剂盒

产品及特点
大肠杆菌是生物制品生产中应用较为广泛的宿主细胞之一。理论上，存在于生物制品中的微量大肠杆菌RNA残留都可能转导到人体细胞，最后可能导致癌变或其他病理变化。因此，宿主细胞RNA残留量的控制是生物制品质量控制中非常重要的环节，对残留RNA检测具有重要的意义。为此本公司，开发了基于荧光定量RT-PCR技术的、专门用于检测样品中大肠杆菌总RNA残留的本产品，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到0.001pg/μL。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物和探针是根据大肠杆菌RNA高度保守区设计，不会跟其他生物的RNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量RT-PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                               编号              规格            包装
探针法qRT-PCR缓冲液                                990504a       0.5 mL   0.5 mL绿盖管
探针法qRT-PCR酶混合液V2.0                    990504bv2    0.5 mL    0.5 mL红盖管
荧光PCR专用模板稀释液                            180701                1 mL    1.5 mL绿色盖
大肠杆菌qPCR引物-探针混合液              yp15-157               150 μL    0.5 mL棕色管
大肠杆菌RT-PCR阳性对照(100pg/μL)        pc15-157R-HJB    50 μL   0.5 mL黄色盖
使用手册                                                    sc15-157R                1份          无

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为12个月。

自备试剂
样品RNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以100pg-0.001pg/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5 μL 1×100pg/μL 的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10pg/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1pg/μL 的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得100ng/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到从100pg/μL 到1ng/μL 共6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品RNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸纯化试剂盒所要求的其实样本体积相同。NC可以用水替代。本试剂盒跟市场上大多数核酸纯化试剂盒兼容。

三、Probe qRT-PCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
8.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于RT-PCR阴性对照（用水做模板），1个用于RT-PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
9.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                        样品管N+2个    RT-PCR阴性对照    标准曲线样品管（1-6管）
探针法qRT-PCR缓冲液                            各10 μL                10 μL                                  各10 μL
探针法qRT-PCR酶混合液v2                 各1 μL                 1 μL                                    各1 μL
大肠杆菌qRT-PCR引物-探针混合液         各3 μL                 3 μL                                    各3 μL
N+2个待测RNA样本                                各7 μL              不加                                    不加
超纯水                                                   不加                 7 μL                                    不加
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）    不加            不加                   各7μL（2号样到2号管，3号样到3号管…）
10.盖上盖子后上机，按下面参数进行RT-PCR：
过程                温度    时间
逆转录                50℃    15 min
预变性              95℃    10 min
PCR反应
（45个循环）    94℃    20 sec
                         53℃    30 sec（采集FAM通道的荧光信号，TAMRA为淬灭基团）

五、数据处理
11.如果扩增阳性对照(包括标曲样本)或样本制备阳性对照结果为阴性，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要重做扩增或制备或跟厂家联系。如果RT-PCR阴性对照或样本制备阴性对照结果为阳性，说明环境污染，则整个扩增或制备实验无效，不需要分析数据，需要跟厂家联系。
12.如果阴性对照和阳性对照正常，则实验有效，可以进入后续分析。
13.对定量检测，以标曲样本浓度的log值为横轴，分别以阳性标准曲线样本的Ct值（FAM通道）为纵轴，绘制标准曲线，r2必须大于0.95。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出RNA浓度的log值，再推算出RNA的浓度。
14.对定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照FAM通道的Ct必须大于或等于40。阳性对照FAM通道的荧光信号必须有对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于或等于35。对待测样品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40则为阴性，如果小于或等于35则为阳性。如果在35-40之间，则重复一次。重复实验的Ct值如果大于或等于40则为阴性，如果小于40，则为阳性。

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