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大肠杆菌细胞基因组DNA残留探针法qPCR试剂盒

发布时间：2026/1/12 15:02:31 阅读次数：7

CAT#:JW-15-175
低温运输，-20℃保存

大肠杆菌细胞基因组DNA残留探针法qPCR试剂盒

产品及特点
大肠杆菌是生物制品生产中应用较为广泛的宿主细胞之一。理论上，存在于生物制品中的微量DNA杂质都可能转导异源基因到人体细胞，最后导致癌变或其他病理变化。因此，中国药典2020年版三部规定，以细胞基质生产的生物制剂DNA残留量不能超过100pg/剂，以细菌或真菌基质生产的疫苗DNA残留量不能超过10fg/剂。由于宿主细胞DNA残留量的控制是生物制品质量控制中非常重要的环节，因此本公司基于荧光定量PCR技术，开发了专门用于检测样品中大肠杆菌细胞基因组DNA残留的本产品，它具有下列特点：
1.即开即用，用户只需要提供样品DNA模板。
2.引物和探针经过优化，分析灵敏性高，可以达到0.1fg/反应。
3.提供阳性对照，便于区分假阴性样品。
4.特异性高，引物和探针是根据大肠杆菌细胞基因组DNA高度保守区设计，不会跟其他生物的DNA发生交叉反应。
5.既可用于定性检测，又可用于定量检测。用于定量检测时线性范围至少为5个数量级。
6.本产品足够50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应。
7.本产品只能用于科研。

规格及成分
本产品采用5孔盒包装
成分                                                                                           编号              规格           包装
2×Probe qPCR MasterMix                                                    981201              0.5 mL    0.5 mL本色盖
荧光PCR模板专用稀释液                                                    180701               1 mL   1.5 mL绿色盖
探针法qPCR特异性增强剂                                                    230302              50 μL    0.5 mL蓝盖管
大肠杆菌细胞基因组DNA残留qPCR引物-探针干粉            yp15-39800          50 次    1.5 mL棕色管
大肠杆菌细胞基因组DNA残留qPCR阳性对照(100pg/μL)    pc60908-39800    50 μL    0.5 mL黄色盖
使用手册                                                                            15-175sc                1份           无
注意：引物-探针干粉在使用前需要短暂离心，然后在离心管中加入162uL的超纯水充分混匀后再使用，未用完的需要-20℃保存。

运输及保存
低温运输，-20℃保存，保存期限为24个月。

自备试剂
超纯水，样品DNA。

使用方法
一、稀释标准曲线样品（以10pg-0.1fg/μL这6个10倍稀释度为例）。由于标准品浓度非常高，因此下列稀释操作一定要在独立的区域进行，千万不能污染样品或本试剂盒的其他成分）。为增加产品稳定性和避免扩散传染性病原，本产品不提供活体样品做阳性对照，只提供无传染性的DNA片段作为阳性对照。
1.标记6个离心管，分别为6，5，4，3，2，1。
2.用带芯枪头分别加入45 μL 荧光PCR专用模板稀释液，最好用带芯枪头，下同）。
3.在6号管中加入5 μL 1×100pg/μL的阳性对照(试剂盒提供)，充分震荡1分钟，得1×10pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
4.换枪头，在5号管中加入5 μL 1×10pg/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得1pg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
5.换枪头，在4号管中加入5 μL 1pg/μL的阳性对照(上步稀释所得)，充分震荡1分钟，得100fg/μL的标准曲线样品。放冰上待用。
6.重复上面的操作直到得到从10pg/μL到0.1fg/μL 共6个稀释度的标准曲线样品。放冰上待用。

二、样品DNA的制备
7.如果有N个样品，最好设置N+2个提取，多出的一个是PC（样品制备阳性对照），一个是NC（样品制备阴性对照）。可以用10μL上步所得4号稀释液再加上一定量的水使总体积跟核酸制备试剂盒所要求的起始样本体积一样，以此作为PC。另外用水作为NC。
8.用自选方法纯化样品的DNA，本试剂盒跟市场上大多数样品DNA提取试剂盒兼容。也可以选购本公司的相关产品或免核酸提取样本释放剂

三、Probe qPCR反应（20μL体系，在样品制备室进行）
9.如果做定量分析并且只做1次重复，则标记N+9个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），6个用于标准曲线。如果做定性分析并且只做1次重复，则标记N+4个PCR管，其中N+2个用于上步得到的N+2个样品，1个用于PCR阴性对照（用水做模板），1个用于PCR阳性对照（直接用第6步第4号管的阳性对照稀释液做模板）。下面只以定量分析为例描述操作步骤。
10.在标记管中按下表加入各成分（本表只列出一次重复。样品管和阴性对照设置完毕后才设置阳性对照，并且阳性对照样品要等所有管子盖上盖子储存好后最后加）：
成分                                                                     样品管N+2个    PCR阴性对照    标准曲线样品管（1-6管）
2×Probe qPCR MasterMix                                         各10 μL            10 μL                   各10 μL
大肠杆菌细胞基因组DNA残留qPCR引物-探针混合液    各3 μL         3 μL                    各3 μL
探针法qPCR特异性增强剂                                           1μL                    1μL                    1μL
N+2个待测DNA样本                                                       6μL                    -                           -
超纯水                                                                              -                  6μL                 -
第6步所得标准曲线样品稀释液（1-6号）                    -                  -         各6μL（1号样到1号管，2号样到2号管…）
11.盖上盖子后上机，按下面参数进行PCR：
过程               温度    时间
预变性               95℃    10 min
PCR反应
（40个循环）    94℃    20 sec
                          53℃    30 sec(采集FAM通道的荧光信号，淬灭基团为TAMRA)

四、数据处理
12.以阳性对照浓度的log值为横轴，以Ct值为纵轴，绘制标准曲线。再以待测样品的Ct值从标准曲线上推算出样品DNA浓度的log值，再通过样品DNA浓度的log值推算出其浓度。
13.如果把本试剂盒用于定性检测，只判断阳性或阴性，则阴性对照必须无Ct或Ct大于或等于35。阳性对照必须有荧光对数增长，有典型扩增曲线，Ct值应该小于35，否则实验无效。如果实验有效，则分析待测样品，如果无Ct或Ct大于或等于35，则为阴性。如果Ct小于35则为阳性

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