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iPS细胞完全培养基试剂盒说明书

发布时间：2026/4/18 11:37:33 阅读次数：4

1.试剂和材料
iPS细胞完全培养基试剂盒
成分                                    规格    数量    储存条件
iPS细胞基础培养基     500mL    1瓶     2-8℃
iPS细胞培养基添加剂        20mL   1支    -20℃

所需的其它试剂和材料
产品                               规格
Y27632                          1mg
Matrigel                          5mL
iPS细胞消化液               500mL
ES细胞专用冻存液          100mL

2.培养流程
2. 1试剂的制备
2.1.1 完全培养基制备
2.1. 1在室温（ 15-25℃) 或冰箱内（2-8℃) 过夜解冻细胞培养基添加剂，可在无菌条件下将添加剂分装为适量的工作等份，并在-20℃下冻存。冷冻的分量须在3个月内用完。解冻后的分量应该一天内制备成完全培养基。请勿在解冻后再次冷冻。
2.1.2.在无菌条件下将20mL的添加剂全部解冻后加入到500mL的基础培养基中，充分混匀。完全培养基在（2-8℃)下储存时刻维持稳定状态最多2-3周，或在-20℃下冷冻时刻维持稳定状态最多3个月。在室温（ 15-25℃) 或冰箱内（ 2-8℃) 过夜解冻冷冻的培养基，不要长时间放在37℃水浴内加热培养基。
如果在无菌条件下制备，细胞完全培养基可直接使用。

2.1.2 Matrigel工作液的配制与包被
鉴于基质胶的操作环境要求比较严格，为保证您的实验顺利，特此对以下几个方面进行温馨提示：
1. 收货时，首先确认还有干冰， Matrigel成固态，液面水平，如有异常请及时拍照取证并联系我们。
2. 整个Matrigel只能分装一次，在分装前，要先放4℃冰箱（最好先把Matrigel插在冰上，然后放入4℃冰箱）过夜，且分装用的枪头、 EP管等都要提前-20℃预冷（基质胶在10℃以上会发成胶凝固导致基质胶报废），整个分装过程都需在冰上进行，且以后每次试验时拿出本次用量所需的基质胶。
3. 实验人员手心不要接触基质胶，如：要手持装有Matrigel的EP管的上方，防止体温使基质胶成胶凝固。
4. Matrigel的稀释比例建议为100倍稀释。

本库建议的配制Matrigel工作液方法：
1. 稀释前将Matrigel放入4℃冰箱过夜融化。
2. 将适量体积的稀释液（ DMEM/F 12或PBS）置4℃冰箱预冷。
3. 将融化的Matrigel与稀释液从冰箱中取出并打开盖子，用移液管吹吸稀释液几次以冷却移液管，并吸取少量稀释液加入Matrigel管中混匀，将Matrigel转移到稀释液中，并吹打混匀。（因为Matrigel遇15℃以上温度就会成凝胶粘在原装玻璃壁和移液管壁上，故Matrigel从冰箱拿出来以后尽快打开盖子并转移到预冷的稀释液中，吸取Matrigel的移液管一定要冷却）。
4. 立即用稀释后的Matrigel包被培养板或培养皿。对于6孔板，每个孔使用1mL稀释后的Matrigel ，对于6cm的培养皿，每个孔使用2mL稀释后的Matrigel ，晃动培养板使Matrigel溶液均匀的分布在表面上。
5. 使用前，包被的培养板应放在培养箱（ 37℃) 下至少1h 。请勿让培养板脱水。在培养板可供使用之前，请勿移除Matrigel溶液。
如果不立即使用，培养板必须密封，以防止脱水。包被后的培养板可在2-8℃下最多储存7天。
如果Matrigel溶液并未完全覆盖表面，则无法实验最佳的细胞培养，因此，不建议使用含有溶液已蒸发区域的培养板。
如果已将培养板在2-8℃下储存，则在移除Matrigel溶液之前，将培养板在培养箱（ 37℃) 下放置30min。

2.1.3 Y27632的配制
Y27632粉末溶解在PBS中，配制成浓度未10mM的储存液， 0.22μm滤膜过滤除菌。分装后冷冻于-20℃。
Y27632提高复苏和传代后的克隆形成率，所以只在复苏和传代步骤添加（ 1: 1000 ，即终浓度为10μM），换液时不添加。

2.2.复苏
在开始复苏前，将所有试管、预热后的培养基和培养皿准备好，已确保尽快完成复苏过程。
将冻存管从液氮中取出，快速在37℃水浴槽中解冻，轻柔持续地摇动冻存管，直到只剩下一个小冷冻团。从水浴槽取出冻存管， 70%乙醇擦拭进行消毒。
使用移液管将冻存管中含有iPS细胞的冻存液轻轻转移至一个含有5-6mL已经预热的完全培养基的15mL离心管中，过程必须轻柔防止吹散细胞团。
室温300g离心5min。
吸出培养基，确保细胞团完整。
然后缓慢加入1mL完全培养基，用手指轻弹离心管底部，使细胞团脱离底部并分散。
轻轻的将此1mL细胞悬液转移至已包被的培养皿/板/瓶，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632 ，终浓度为10μM。
将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632 ，但培养基需提前预热）。

2.3.传代
当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。传代前，准备 37 ℃预热好的无钙镁PBS 溶液及消化液，完全培养基。
吸走上清，并加入37℃预热好的PBS 溶液清洗1次。
加入适量（按 6 孔板每孔加 1 mL ， 6cm 皿加 2 mL ， 10cm 皿加 3 mL 的量）的 37℃预热好的消化液。
37℃放置1-2min ，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。
加入适量的完全培养基终止消化。
移入离心管， 300g离心5min。
离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。
传代比例为 1 ： 6—1 ： 8 ，根据最终培养细胞的液体体积，加入ROCK inhibitor Y27632 ，终浓度为10μM。将培养皿/板/瓶置于37℃培养箱中，每天更换培养基（换液不需要再添加Y27632 ，但培养基需提前预热）。

2.4.冻存
当集落变得较大、中心变得密集、明亮（对比边缘），相邻的集落开始融合时，此时可进行传代。传代前，准备37 ℃预热好的无钙镁 PBS 溶液及消化液，完全培养基。
吸走上清，并加入37℃预热好的 PBS 溶液清洗1次。
加入适量（按 6 孔板每孔加 1 mL ， 6cm 皿加 2 mL ， 10cm 皿加 3 mL 的量）的 37℃预热好的消化液。
37℃放置1-2min ，用手指轻弹皿/板/瓶身，显微镜下观察到大部分克隆边缘开始脱离培养皿/板底，克隆内部大部分细胞成团脱落。
加入适量的完全培养基终止消化。
移入离心管， 300g离心5min。
离心后重悬（重悬步骤参照复苏4-5步）。
使用预冷的冻存液轻轻的重悬细胞团，然后将细胞悬液转移至冻存管，冻存按 6 孔板每孔冻 1 支， 6cm 皿冻 2-4支， 10cm 皿冻 6-12 支。