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电击法细胞融合试剂盒实验步骤

发布时间：2022/8/4 11:29:58 阅读次数：274

电击法细胞融合试剂是一种旨在促进实验动物细胞合二为一的电击融合性介质和权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用的细胞种类包括小鼠和大鼠细胞株、人体细胞株、胚胎细胞株、肿瘤细胞株、悬浮细胞株、植物细胞株等。应用于融合杂交瘤细胞产生抗体，肿瘤细胞和人体树突状细胞融合产生免疫细胞，以及人鼠细胞融合产生染色体单体等。产品严格无菌，即到即用，融合效率高。

实验步骤

在实施细胞融合前，要选择好两个带有筛选标记的父代细胞株，例如一个带有HPRT缺陷型（G&VS10004试剂盒）且抗生素抗性的，另一个反之。存活的细胞杂合子具有HPRT和抗生素抗性。当开始下列操作之前，先将清理液（Reagent A）、融合液（Reagent B）、用户自备的完全细胞培养液放进37℃恒温水槽预热。然后开始下列操作。

1．在融合操作前24小时，将两个75cm²细胞培养瓶里的父代细胞用胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液脱离传代一次（注意：此步骤非常重要）

2．次日，分别抽掉两个待融合的父代细胞培养瓶里（75cm²细胞培养瓶）的培养液

3．分别加入xx毫升 清理液（Reagent A），清洗生长中的细胞表面

4．分别抽掉5毫升清洗液

5．分别加入3毫升用户自备的胰蛋白酶乙二胺四乙酸混合液，铺满整个培养平面

6．置入37℃培养箱3分种

7．用手震动培养瓶，使细胞脱落，然后分别加入xx毫升清理液（Reagent A）

8．充分混匀后，在血细胞计数器上进行细胞计数

9．分别加入3 x 10⁶的两个父代细胞合并到一个15毫升锥形离心管（注意：如果其中一个为类淋巴母细胞（linphoblastoid），则需要12 x 10⁶细胞总量）

10．放进台式离心机离心5分钟，速度为300g

11．小心抽去上清液

12．加入xx毫升清理液（Reagent A），充分混匀

13．放入台式离心机离心5分钟，速度为300g

14．小心抽去上清液，用手指轻轻弹击直至细胞颗粒群松散

15．重复实验步骤12至14二次

16．加入xx毫升融合液（Reagent B），充分混匀

17．放入台式离心机离心5分钟，速度为300g

18．小心抽去上清液，用手指轻轻弹击直至细胞颗粒群松散

19．重复实验步骤16至18一次

20．加入xx微升融合液（Reagent B）

21．轻柔枪头上下抽吸2至3次混匀细胞

22．转移到2毫米电击杯

23．插入到电击槽，实施电击（建议使用BTX Enhancer 400：

30AC Volts，22 秒，5 post fusion AC seconds

300DC volts， 15毫秒，3 pulses

0（zero）重复

24．移取电击杯里的细胞到50毫升锥形离心管

25．加入50毫升用户自备的DMEM完全培养基，混匀细胞

26．分别移取500微升到2个48孔板里的每一个孔里

27．放进37℃细胞培养箱孵育24小时

28．小心抽去培养孔里的培养液

29．分别加入500微升用户自备的筛选培养液（例如HAT/G418筛选培养液等）

30．开始细胞筛选，直至获得融合杂合子细胞克隆（20至28天）

上海极威生物科技有限公司（Shanghai JIwei Biological Technology Co., Ltd.）成立于上海，是一家专业从事“产品研发、市场销售、技术服务”为一体的高科技生物技术公司。极威生物依托国内外技术研发人才的优势，由留美资深科学家与数位国内多年从事生物领域研究的博士、硕士等高校生物领域研究人员共同创立，在科学研究和医疗检测领域享有极高的声誉，经过多年的努力发展已成为专业供应各类生物科研用品的公司，长期专注于生物领域，旗下产品种类众多。