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贴壁细胞传代操作步骤

发布时间：2022/11/18 14:56:26 阅读次数：180

一、细胞传代前，将实验所需的器材全部消毒放入超净台

1、取枪头盒，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

2、取提前配好的完全培养基，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

3、取15ml离心管，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

4、取移液管，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

5、取T25瓶，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

二、从37℃培养箱中取出培养瓶，放到显微镜下观察细胞

如果细胞密度大于85%时，则可以进行传代，不确定细胞是否可以传代时，可以联系极威生物细胞技术员帮忙判断，培养瓶转入超净台，使用吸引器吸取洁净枪头，将T25培养瓶内的上清吸除，为避免污染，在操作过程中，要避免吸管管身触碰到培养瓶内壁，吸除干净后丢弃吸管枪头。

用移液管吸取2ml的PBS，加入到T25培养瓶内，浸润细胞，操作时仍要小心吸取，以免污染，使用后的移液管装回原包装内再丢弃，开拧瓶盖时，为避免污染，手指尽量远离瓶口，轻微晃动T25培养瓶，让细胞浸润30-60S，待培养瓶内的培养基冲洗干净后，用吸引器吸取新的枪头，并吸除T25瓶内的PBS。

取新的移液管吸取2ml胰酶，加入到T25培养瓶内，使用后的移液管装回原包装内再丢弃，将加有胰酶的T25培养瓶，放进37℃培养箱内进行消化，细胞消化时间2-5min，细胞的特性不同，消化的时间也不同，建议从2分钟后开始，每过一分钟去观察细胞状态，是否已经消化完成，切忌消化过度，消化完成后，放到显微镜下观察细胞状态，如果细胞状态变圆脱落，则可终止消化，

取新的移液管，吸取2ml含10%血清的完全培养基，加入到T25培养瓶内终止消化，吸取完全培养基时，为避免污染，注意手不能触碰到瓶口，为了让细胞更好的培养，建议使用厂家出品的完全培养基，因为，厂家出品的完全培养基，是经过千种细胞的培养测试后，挑选出来的优品，终止消化后，用完培冲洗培养瓶内壁，使细胞完全脱落，并混合均匀。

将所有细胞悬液，转入到15ml离心管内，进行离心操作，离心时，细胞配平放置，离心力200g，根据细胞特性不同，离心5-10min，离心后，观察细胞是否已经完全沉淀，确认完全沉淀后，在超净台内，使用吸引器吸引新的枪头，吸除离心管内的废液，吸除时，需要注意观察，避免将沉淀的细胞吸除。

取新的移液管，吸取7ml完全培养基，加入到离心管内，进行轻微吹打，让细胞重悬并分开，吹打均匀后，将细胞悬液全部吸入移液管，按照所需比例转入培养皿内，并来回摇晃，使细胞在底部分布均匀，将培养皿放入37℃培养箱内，静置培养。

注：贴壁细胞传代注意事项

1、注意传代前的密度，必须在85%以上（特殊细胞除外）

2、注意胰酶的消化时间。（避免细胞消化过度；也不能提前终止消化，强行将细胞吹打下来）若有少量细胞无法从皿底脱落，属于正常现象。若有大量细胞无法从皿底脱落，需延长消化时间。

3、吹吸的力度要轻柔，吹打过度会导致大量单细胞死亡

贴壁细胞传代操作结束