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细胞冻存操作步骤

发布时间：2022/11/18 14:59:40 阅读次数：200

一、细胞冻存前，将实验所需的器材全部消毒放入超净台，

1、取枪头盒，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

2、取提前配好的完全培养基，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

3、取15ml离心管，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

4、取移液管，用75%的酒精全方位喷洒，消毒并擦干后，放入超净台，

冻存前，取出细胞培养瓶，放置显微镜下观察细胞状态，如果细胞密度大于95%时，则可以进行冻存，取来细胞，放进超净台，使用吸引器吸取洁净枪头，将T25培养瓶内的上清吸除，吸除上清时，要避免吸管管身触碰到T25培养瓶内壁，而造成污染。

吸除干净后丢弃枪头，取移液管吸取2ml的PBS，加入到T25培养瓶内，浸润细胞，使用移液管时，需要避免移液管管身触碰到容器内壁，而造成污染，使用后的移液管，装回原包装内丢弃，开拧瓶盖时，需要避免手触碰到瓶口而造成污染。

轻微晃动T25培养瓶，让细胞浸润30-60min，待培养瓶内的培养基冲洗干净后，用吸引器吸取新的枪头，吸除T25培养瓶内的PBS，吸除时，要缓慢插入，沿着侧壁吸弃培养基，注意小心操作，以免将细胞吸走。

取新的移液管吸取2ml胰酶，加入到T25培养瓶内，使用后的移液管装回原包装内丢弃，将加有胰酶的T25培养瓶，放进37℃培养箱内，细胞消化2-5min，细胞的特性不同，消化的时间也不同，建议从2分钟后开始，每过一分钟去观察细胞，是否已经消化完成，切忌消化过度，消化完成后，放到显微镜下观察细胞状态，如果细胞状态变圆脱落，就可以终止消化。

取新的移液管，吸取2ml含10%血清的完全培养基，加入到T25培养瓶内终止消化，吸取完全培养基时，为避免污染，注意手不能触碰到瓶口，为了让细胞更好的培养，建议使用厂家出品的完全培养基，因为，厂家出品的完全培养基，是经过千种细胞的培养测试后，挑选出来的优品，终止消化后，用完培冲洗培养瓶内壁，使细胞完全脱落，并混合均匀。

将所有细胞悬液，转入到15ml离心管内，进行离心操作，离心时，细胞配平放置，离心力200g，根据细胞特性不同，离心5-10min，离心后，观察细胞是否已经完全沉淀，确认完全沉淀后，在超净台内，使用吸引器吸引新的枪头，吸除离心管内的废液，吸除时，需要注意观察，避免将沉淀的细胞吸除。

冻存液提前放在冰上预冷，使用前消毒擦干后放入超净台，用心的移液管吸取2ml冻存液，加入到离心管内反复吹打，重悬后，将移液管内的细胞悬液，分装到1ml的冻存管内，并放进梯度冻存盒。

离开超净台前检查并拧紧冻存管管盖，将梯度冻存盒放进-80℃冰箱进行降温，24小时后，将冻存管转入到液氮罐内保存。

注：冻存细胞注意事项

1、冻存液的配置：完培+10%DMSO

2、按照复苏所需要的量1~10⁶/mL，每管1mL冻存

3、细胞必须使用梯度冻存盒

4、80℃过夜后，将冻存细胞转移至液氮保存