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发布时间：2023/9/5 11:41:55 阅读次数：187
细胞CSK激酶活性活性光谱法定量检测试剂盒产品说明书
主要用途
细胞CSK激酶活性光谱法定量检测试剂是一种旨在通过多肽底物受到CSK激酶磷酸化后，进而由丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶连续循环法反应系统，测定产生ADP过程中，伴随的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的氧化反应， 即采用光谱法测定其氧化后峰值的变化，以分析细胞裂解样品中CSK激酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种细胞裂解萃取液样品（动物、人体）、部分或完全纯化酶样品中CSK激酶的定量检测，以及抑制剂和激活剂的筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，高度敏感。
技术背景
C-末端Src激酶（c-terminal Src kinase；CSK；EC2.7.10.2）属于络氨酸激酶（tyrosine protein kinase）家属成员之一。其含有SH2、SH3和络氨酸激酶结构域。CSK与YTH域家庭成员1（YTH domain containing 1；YTHDC1）、Disabled-2蛋白（DAB2）、肌营养不良蛋白聚糖（Dystroglycan）、胰岛素类生长因子1受体（Insulin-like growth factor 1 receptor）等蛋白发生反应。CSK激酶磷酸化Src家属成员的c-末端保守的络氨酸，尤其是粒性白细胞特异性蛋白络氨酸激酶（leukocyte specific protein tyrosine kinase），以及LYN和FYN激酶等，从而降低其催化活性。其磷酸化目标序列为 KKKKEEIYFFF。基于底物KKKKEEIYFFF，在ATP的存在下，受到CSK激酶的磷酸化，获得产物磷酸化多肽，进而通过丙酮酸激酶（pyruvate kinase；PK）和乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase；LDH）反应系统中，还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）转化为氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide；NAD），其吸光峰值的变化（340nm），来定量分析CSK激酶的活性。其反应方式为：
产品内容
清理液（Reagent A） 毫升
裂解液（Reagent B） 毫升
缓冲液（Reagent C） 毫升
酶促液（Reagent D） 微升
反应液（Reagent E） 微升
底物液（Reagent F） 微升
阴性液（Reagent G） 微升
产品说明书 1份
保存方式
保存清理液（Reagent A）在4℃冰箱里；其余的保存在－20℃冰箱里，严格避免光照和反复冻融；有效保证6月
用户自备
CSK激酶：用于抑制剂筛选
1.5毫升离心管：用于样品保存的容器
15毫升锥形离心管：用于样品处理的容器
细胞刮脱棒：用于贴壁细胞脱离
（微型）台式离心机：用于细胞预处理
比色皿或酶标板：用于光谱分析操作的容器
分光光度仪或酶标仪：用于样品光谱分析
实验步骤
一、 待测样品准备
1． 准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞（1至5 X 106细胞）
2． 小心加入xx毫升清理液（Reagent A），覆盖生长表面
3． 小心抽去清理液
4． 使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞（注意：避免使用胰酶消化）
5． 加入xx毫升清理液（Reagent A），混匀细胞
6． 移入到预冷的15毫升锥形离心管（注意：悬浮细胞从这一步骤开始）
7． 放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g
8． 小心抽去上清液
9． 加入xx微升裂解液（Reagent B），充分混匀
10． 转移到预冷的1.5毫升离心管
11． 强力涡旋震荡15秒
12． 置于冰槽里孵育30分钟
13． 放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
14． 小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管
15． 移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－JW-30030.1）
16． 即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作
二、 测定准备
1． 准备好待测样品（例如细胞裂解悬液等），置于冰槽里
2． 设定好分光光度仪（温度为30℃）：波长为340nm，间隔1分钟，读数6次（共5分钟），并置零
3． 缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度
三、 背景对照测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反应液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入xx微升阴性液（Reagent G）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
四、 样品测定
1． 移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿
2． 加入xx微升酶促液（Reagent D）
3． 加入xx微升反应液（Reagent E）
4． 加入xx微升底物液（Reagent F）
5． 放进30℃培养箱里静置3分钟
6． 加入5微升待测样品（注意：50微克细胞裂解蛋白；样品须溶解）
7． 上下倾倒数次，混匀（限定在3秒之内）
8． 即刻放进分光光度仪检测，此为样品总活性读数：340波长读数0分钟 －340波长读数5分钟
五、 计算样品活性
六、 酶标板测定
1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景对照和样品
2． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到96孔板中
3． 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
4． 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
5． 分别加入xx微升底物液（Reagent F）
6． 轻轻摇动96孔酶标板
7． 在30℃温度下孵育3分钟
8． 分别加入xx微升阴性液（Reagent G）或待测样品（50微克细胞裂解悬液蛋白）到相应孔中（注意：样品须清澈）
9． 轻轻摇动酶标板
10． 即刻放进酶标仪检测：0分钟读数和5分钟读数
11． 活性计算：
七、抑制剂筛选
1． 在96孔酶标板上做好相应标记：背景、完全活性和待测抑制剂样品
2． 按下表加入试剂，进行样品预处理
| 内容物 | 空背景对照 | 样本背景 | 完全酶活性 | 待测抑制剂酶活性 |
| 缓冲液（Reagent C） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | xx微升 |
| 阴性液（Reagent G） | xx微升 | xx微升 | xx微升 | —— |
| 待测抑制剂 | —— | xx微升 | ―― | xx微升 |
| 用户自备的纯化酶 | —— | —— | xx微升（1毫单位） | xx微升（1毫单位） |
| 96孔板每孔总量 | 空背景对照孔 （20微升） | 样本背景孔 （20微升） | 完全活性孔 （20微升） | 待测抑制剂样品孔 （20微升） |
| 轻轻摇动酶标板，混匀，放进30℃培养箱里孵育30分钟。然后进行下列操作 | ||||
3． 分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的96孔板的所有孔里
4． 分别加入xx微升酶促液（Reagent D）
5． 分别加入xx微升反应液（Reagent E）
6． 分别加入xx微升底物液（Reagent F）
7． 轻轻摇动酶标板
8． 在30℃温度下孵育3分钟
9． 加入20微升上述预处理的待测样品
10． 即刻放进30℃酶标仪检测：测读30分钟
11． 抑制活性计算：
注意事项
1． 本产品为25次操作，包括背景操作
2． 操作时，须戴手套
3． 系统操作过程中，背景测定只需1次
4． 样品处理忌用磷酸缓冲溶液
5． 样品须澄清，至关重要
6． 加入样品启动反应后3秒内即刻光谱测定
7． 测定值由高到低变化；测定可持续30分钟
8． 光谱测定后，比色皿须清洗彻底
9． 样本测定0分钟读数高于5分钟读数表明具有酶活性
10． 建议待测样本蛋白浓度为50微克/5微升（本公司提供 Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－JW-30030.1）
11． 如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度
12． 可以使用CSK抑制剂（ASN 2324598）作为抑制剂对照或阴性对照
13． CSK激酶活性单位浓度定义：在30℃温度下，pH 7.5条件下，每分钟内能够氧化1微摩尔还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作为一个活性单位
14． 本公司提供系列蛋白激酶检测试剂产品
质量标准
1． 本产品经鉴定性能稳定
2． 本产品经鉴定检测敏感
使用承诺
极威生物秉着“信誉至上、客户满意、质量承诺”的宗旨为我们的用户提供优质产品和服务。用户收到货后，应按照产品说明书上的规定妥善保管并在有效期内使用。我们的产品在销售前已作严格的质量鉴定，保证说明书所述的使用效果。在货到后10天内若发现确属本产品的质量问题，请立即以书面形式（实验报告）与本公司联系，并将该产品退回，经检验确系产品质量所致，本公司负责更换产品。如系使用者错误操作所致，本公司不承担由此造成的损失。
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